肌腱干细胞修复跨栏运动员肌腱损伤动物模型的研究

发布时间：2020-11-08 21:48

　　在田径运动中,短跨类项目跨栏运动员跟腱(人体最大的肌腱,以下统称为肌腱)组织易发生损伤,且恢复慢,严重影响运动员的竞技成绩和运动生涯,目前这成为临床医学和运动医学主要攻克的难点,这种损伤主要有三种机制:撕裂、拉力过载及挫伤。治疗肌腱损伤的传统方法包括物理疗法、手术疗法、冰冻疗法等,但这些疗法治疗周期长,修复慢且易修复后肌腱生理功能和机械性能下降,易造成再次损伤。国务院在《国家中长期科学和技术发展规划纲要(2006-2020)》中强调指出要全方位大力推进干细胞修复运动损伤组织的相关技术实验体系;六部委联合发布《“十三五”健康产业科技创新专项规划》中明确要求加快干细胞与再生运动医学的临床应用。干细胞的自我更新、高倍速增殖能力和多项分化潜能为个体组织发育及损伤组织再修复提供了重要理论和实验基础。肌腱干细胞的发现及其生物学特性的研究为肌腱组织病理机制的探究提供了理论基础,同时为干细胞修复肌腱损伤提供实验依据。本研究运用文献资料法、数理统计法、专家访谈法和实验法等研究方法主要做了体外分离培养鸭胚肌腱干细胞,优化肌腱干细胞最佳培养体系并建立体外扩增培养技术体系,探究了肌腱干细胞的增殖、分化等一系列生物学特性和多项分化潜能,构建了动物肌腱损伤模型并用肌腱干细胞移植修复,探索体内移植后干细胞的迁移和修复作用,得到以下结论:1.使用I型胶原酶、中性蛋白酶和胰酶通过机械分离法分离鸭胚来源的肌腱干细胞,并通过加不同因子的全培养基纯化细胞,纯化后的细胞能够在最优培养体系下传至31代,通过中代次细胞的复苏与冻存前进行形态学观察,细胞仍有很强的增值能力;通过免疫组织化学鉴定、流式细胞术和RT-PCR鉴定肌腱干细胞的特异性表面标记物,免疫荧光鉴定显示细胞对CD44、CD105、Collagen I、Collagen III、Oct4、Tenascin-C都呈阳性;流式细胞术显示细胞对CD44、CD166、CollagenI、CollagenIII、Tenascin-C阳性率都在90%以上;RT-PCR显示细胞对CollagenI、CollagenIII、Nucleostemin、CD44、Tenascin-C特异性基因及表面抗原均呈阳性表达,表明分离的细胞为肌腱干细胞并具有干细胞特性;通过克隆能力形成、生长曲线绘制等生物学进行肌腱干细胞鉴定;通过不同诱导体系诱导肌腱干细胞分化成成脂细胞、成骨细胞、成软骨细胞,诱导后的成脂细胞用油红O染色呈现红色脂滴,RT-PCR检测显示脂肪细胞特异性分子标记LPL和PPAR-γ呈阳性表达;成骨细胞诱导成功后出现骨细胞团并用用茜素红染色呈阳性,RT-PCR结果显示成骨细胞特异性分子标记OPN和Runx2呈阳性表达;用软骨诱导液进行诱导分化肌腱干细胞并用阿利新蓝染色液染色呈现蓝染色的酸性糖胺聚糖,表明形成软骨细胞团,RT-PCR检测到软骨细胞特异性基因Sox9和ACAN阳性表达。90%的hESCs分化为其他的细胞类型或者死亡,只有10%能够保留形成所有细胞类型的能力,就是维持它们所谓的“干性”,以上结果表明体外分离培养的跟腱来源肌腱干细胞具有“干性”特征、自我增值能力和多项诱导分化潜能。2.通过I型胶原酶构建小鼠肌腱组织损伤模型,并取样制备石蜡和冰冻切片,结果石蜡切片显示肌腱纤维束严重破坏且排列紊乱,用CM-Dil标记过的肌腱干细胞移植到小鼠肌腱损伤部位,肌腱干细胞能够稳定迁移到损伤组织周围并增殖分化,不同时间梯度取样分析组织及血清学相关指标的连续观察表明:细胞移植治疗组损伤肌腱有较好的修复;血清分析与正常组相比,肌腱干细胞移植组CK值有一定程度下降,表明肌腱干细胞可以修复受损的肌腱组织。总之,本实验研究了跨栏运动员肌腱组织损伤,并在体外分离培养肌腱干细胞,对肌腱干细胞的生物学特性进行了检测并鉴定,探索了其最佳培养体系。通过对肌腱干细胞进行多项诱导分化潜能实验证明了肌腱干细胞具有“干性”特征,构建肌腱干细胞修复小鼠肌腱损伤动物模型,为临床应用基于以干细胞夯实基础的细胞疗法治疗肌腱运动损伤和促进肌腱组织再生提供了实验依据。
【学位单位】：牡丹江师范学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R686.1
【部分图文】：