miR-181a-5p在后纵韧带骨化中的作用和机制研究
发布时间：2022-02-11 12:08
研究背景及目的后纵韧带骨化（ossification of the posterior longitudinal ligament,简称 OPLL）是一种常见的脊柱韧带异位骨化（heterotopicossification,简称HO）疾病。由于椎管内的空间有限,随着骨化物的生长,易造成相应水平的脊髓或神经根受压损伤,导致肢体感觉、运动功能障碍,严重影响人类的健康与生活质量。流行病学调查发现,OPLL主要发生在颈椎和胸椎,该部位所对应的脊髓功能一旦受损,所造成的神经功能障碍往往是广泛的,且对患者生活质量甚至生存时间造成严重的影响。目前有效的治疗方式是通过手术切除骨化物直接减压或通过扩大椎管容积间接减压解除骨化物对脊髓的直接压迫,但该部位手术风险高,手术过成中由于骨化物与硬脊膜往往存在不同程度的黏连,术者往往选择不切除或部分切除骨化物的手术方式,这也对术者的经验和技术提出了很高的要求。术后还存在骨化物继续生长甚至生长加速的情况,使得患者承受二次手术的风险。相关的病因学研究显示,年龄、肥胖、饮食、糖尿病、运动或脊柱的异常活动所造成的机械刺激、某些内分泌疾病,如甲状旁腺功能减退、肢端肥大症等...
【文章来源】：中国人民解放军海军军医大学上海市211工程院校
【文章页数】：105 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
骨化相关mi R-181是OPLL的潜在致病因子。(A)OPLL相关mi RNA/m RNA负调控网络绘制流程图。(B)OPLL中与骨化相关的mi RNA/m RNA交互式网络图。圆形点代表差异表达的m RNA,圆角矩形点代表差异表达的mi RNA。OPLL中上调的基因标记为红色,而下调的标记为绿色。(C)OPLL中表达量最高的10个mi RNA列表。(D)通过实时PCR确定mi R-181a在PLL(n=10)和OPLL(n=10)组织中的表达验证。水平线代表平均值和四分位数。**P<0.01。
为深入研究miR-181a-5p在后纵韧带细胞诱导成骨过程中的作用,我们从临床后纵韧带组织中通过爬壁法提取后纵韧带细胞进行体外培养,如图所示,组织块贴壁培养7-14天后,后纵韧带细胞开始爬出并逐渐向周围增殖,镜下分析可见OPLL与PLL来源的后纵韧带细胞形态相似,与成纤维细胞形态类似,呈梭形,并有少量细长伪足(图1-2A);当组织内细胞基本爬出并在培养瓶中生长汇合至80%密度,常规消化、传代,取部分细胞提取RNA,通过RT-PCR检测miR-181a-5p及miR-181a-3p在两种细胞中的表达含量,结果显示OPLL细胞中miR-181a-5p及miR-181a-3p表达均显著高于PLL细胞,而在两种细胞内,miR-181a-5p表达含量均显著高于miR-181a-3p,进一步提示miR-181a-5p是OPLL细胞成骨分化的关键靶基因;此外,为评估两种细胞的成骨能力,消化收集细胞并按一定密度铺板于24孔板,12小时细胞贴壁后,将普通培养基更换为成骨诱导培养基,分别培养1天、10天、21天收集细胞,通过ALP、ARS染色评估PLL及OPLL来源的后纵韧带细胞成骨能力,结果显示,更换成骨诱导培养基诱导1天时,OPLL、PLL细胞均无明显染色,随着诱导时间的延长,OPLL、PLL细胞均被染色且染色深度呈现明显差别,具体表现为OPLL较PLL细胞ALP、ARS染色更深(图1-2C),表明OPLL较PLL细胞具有更强的成骨表现;为进一步评估两种细胞成骨能力,采用成骨诱导培养基诱导不同时间后,收集细胞RNA,通过RT-PCR检测骨化相关基因(RUNX2、OSX、OPN、ALP)表达,结果表明,成骨诱导培养基诱导PLL及OPLL细胞成骨分化一段时间后,细胞内骨化相关基因表达显著上调,OPLL细胞较PLL骨化相关基因表达变化更为明显(图1-2D)。与此同时,为在细胞层面观察成骨过程中miR-181a-5p及miR-181a-3p表达情况,我们通过RT-PCR检测miR-181a-5p及miR-181a-3p在成骨诱导不同时间点,两种细胞内的表达变化,结果显示miR-181a-5p及miR-181a-3p在OPLL细胞中的表达量随成骨诱导时间延长逐渐升高,增长幅度方面,miR-181a-5p较miR-181a-3p表达量升高更为显著(图1-2E);而PLL细胞经成骨诱导后,miR-181a-5p及miR-181a-3p并未出现明显改变,miR-181a-5p在诱导21天后表达量轻度增加,提示miR-181a-5p在PLL细胞成骨分化中也具有一定作用。(三)mi R-181a-5p/-3p对后纵韧带细胞成骨能力的影响
深入探究miR-181a-5p及miR-181a-3p对后纵韧带细胞成骨分化过程的影响,分别构建miR-181a-5p及miR-181a-3p mimic及inhibitor,通过基因表达操作手段研究miR-181a-5p及miR-181a-3p表达变化对后纵韧带细胞成骨分化的影响,鉴于前期研究发现miR-181a-5p及miR-181a-3p在OPLL中高表达,在PLL中相对低表达,因此,我们计划在低表达的PLL细胞中过表达miR-181a-5p及miR-181a-3p,而在高表达的OPLL细胞中抑制miR-181a-5p及miR-181a-3p表达。消化收集PLL细胞传至24孔板,分为5组,Blank组不转染,NC组转染Scrambled,miR-181a-5p组转染miR-181a-5p mimic,miR-181a-3p组转染miR-181a-3p mimic,另外采用课题组前期研究证实在后纵韧带细胞成骨分化中发挥重要作用的miR-10a-3p转染作为阳性对照,48小时后给予成骨诱导培养21天。分别进行ALP染色、茜素红染色、qRT-PCR、western-blot检测。ALP结果显示,miR-181a-5p能明显增强PLL细胞成骨诱导后着色,转染miR-181a-3p的PLL细胞与NC组比较未出现明显差异(Figure 1-3A)。茜素红染色结果显示miR-181a-5p能明显增加PLL细胞钙结节形成,miR-181a-3p组与NC组比较未见明显差异(Figure 1-3B)。RT-PCR检测结果显示,与NC组比较,miR-181a-5p组RUNX2、ALP、OPN、OSX表达明显升高,miR-181a-3p组骨化相关基因表达量未见明显改变(图1-3C)。western-blot检测结果显示,转染miR-181a-5p可以明显增加RUNX2、OSX蛋白表达量,而转染miR-181a-3p无明显变化(图1-3D)。以上结果表明,miR-181a-5p对PLL细胞成骨分化具有重要调控作用,而miR-181a-3p则没有相应功能。2、干扰miR-181a-5p/3p对OPLL细胞成骨能力的影响
【参考文献】：
期刊论文
[1]miR-144-3p在大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的表达及其靶向调控作用[J]. 陆进,张浩轩,俞鹏,龚义凤,龚喜旺,范强强,杨月. 南方医科大学学报. 2018(09)
[2]TGF-β/BMP signaling and other molecular events: regulation of osteoblastogenesis and bone formation[J]. Md Shaifur Rahman,Naznin Akhtar,Hossen Mohammad Jamil,Rajat Suvra Banik,Sikder M Asaduzzaman. Bone Research. 2015(01)
本文编号：3620251
【文章来源】：中国人民解放军海军军医大学上海市211工程院校
【文章页数】：105 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
骨化相关mi R-181是OPLL的潜在致病因子。(A)OPLL相关mi RNA/m RNA负调控网络绘制流程图。(B)OPLL中与骨化相关的mi RNA/m RNA交互式网络图。圆形点代表差异表达的m RNA,圆角矩形点代表差异表达的mi RNA。OPLL中上调的基因标记为红色,而下调的标记为绿色。(C)OPLL中表达量最高的10个mi RNA列表。(D)通过实时PCR确定mi R-181a在PLL(n=10)和OPLL(n=10)组织中的表达验证。水平线代表平均值和四分位数。**P<0.01。
为深入研究miR-181a-5p在后纵韧带细胞诱导成骨过程中的作用,我们从临床后纵韧带组织中通过爬壁法提取后纵韧带细胞进行体外培养,如图所示,组织块贴壁培养7-14天后,后纵韧带细胞开始爬出并逐渐向周围增殖,镜下分析可见OPLL与PLL来源的后纵韧带细胞形态相似,与成纤维细胞形态类似,呈梭形,并有少量细长伪足(图1-2A);当组织内细胞基本爬出并在培养瓶中生长汇合至80%密度,常规消化、传代,取部分细胞提取RNA,通过RT-PCR检测miR-181a-5p及miR-181a-3p在两种细胞中的表达含量,结果显示OPLL细胞中miR-181a-5p及miR-181a-3p表达均显著高于PLL细胞,而在两种细胞内,miR-181a-5p表达含量均显著高于miR-181a-3p,进一步提示miR-181a-5p是OPLL细胞成骨分化的关键靶基因;此外,为评估两种细胞的成骨能力,消化收集细胞并按一定密度铺板于24孔板,12小时细胞贴壁后,将普通培养基更换为成骨诱导培养基,分别培养1天、10天、21天收集细胞,通过ALP、ARS染色评估PLL及OPLL来源的后纵韧带细胞成骨能力,结果显示,更换成骨诱导培养基诱导1天时,OPLL、PLL细胞均无明显染色,随着诱导时间的延长,OPLL、PLL细胞均被染色且染色深度呈现明显差别,具体表现为OPLL较PLL细胞ALP、ARS染色更深(图1-2C),表明OPLL较PLL细胞具有更强的成骨表现;为进一步评估两种细胞成骨能力,采用成骨诱导培养基诱导不同时间后,收集细胞RNA,通过RT-PCR检测骨化相关基因(RUNX2、OSX、OPN、ALP)表达,结果表明,成骨诱导培养基诱导PLL及OPLL细胞成骨分化一段时间后,细胞内骨化相关基因表达显著上调,OPLL细胞较PLL骨化相关基因表达变化更为明显(图1-2D)。与此同时,为在细胞层面观察成骨过程中miR-181a-5p及miR-181a-3p表达情况,我们通过RT-PCR检测miR-181a-5p及miR-181a-3p在成骨诱导不同时间点,两种细胞内的表达变化,结果显示miR-181a-5p及miR-181a-3p在OPLL细胞中的表达量随成骨诱导时间延长逐渐升高,增长幅度方面,miR-181a-5p较miR-181a-3p表达量升高更为显著(图1-2E);而PLL细胞经成骨诱导后,miR-181a-5p及miR-181a-3p并未出现明显改变,miR-181a-5p在诱导21天后表达量轻度增加,提示miR-181a-5p在PLL细胞成骨分化中也具有一定作用。(三)mi R-181a-5p/-3p对后纵韧带细胞成骨能力的影响
深入探究miR-181a-5p及miR-181a-3p对后纵韧带细胞成骨分化过程的影响,分别构建miR-181a-5p及miR-181a-3p mimic及inhibitor,通过基因表达操作手段研究miR-181a-5p及miR-181a-3p表达变化对后纵韧带细胞成骨分化的影响,鉴于前期研究发现miR-181a-5p及miR-181a-3p在OPLL中高表达,在PLL中相对低表达,因此,我们计划在低表达的PLL细胞中过表达miR-181a-5p及miR-181a-3p,而在高表达的OPLL细胞中抑制miR-181a-5p及miR-181a-3p表达。消化收集PLL细胞传至24孔板,分为5组,Blank组不转染,NC组转染Scrambled,miR-181a-5p组转染miR-181a-5p mimic,miR-181a-3p组转染miR-181a-3p mimic,另外采用课题组前期研究证实在后纵韧带细胞成骨分化中发挥重要作用的miR-10a-3p转染作为阳性对照,48小时后给予成骨诱导培养21天。分别进行ALP染色、茜素红染色、qRT-PCR、western-blot检测。ALP结果显示,miR-181a-5p能明显增强PLL细胞成骨诱导后着色,转染miR-181a-3p的PLL细胞与NC组比较未出现明显差异(Figure 1-3A)。茜素红染色结果显示miR-181a-5p能明显增加PLL细胞钙结节形成,miR-181a-3p组与NC组比较未见明显差异(Figure 1-3B)。RT-PCR检测结果显示,与NC组比较,miR-181a-5p组RUNX2、ALP、OPN、OSX表达明显升高,miR-181a-3p组骨化相关基因表达量未见明显改变(图1-3C)。western-blot检测结果显示,转染miR-181a-5p可以明显增加RUNX2、OSX蛋白表达量,而转染miR-181a-3p无明显变化(图1-3D)。以上结果表明,miR-181a-5p对PLL细胞成骨分化具有重要调控作用,而miR-181a-3p则没有相应功能。2、干扰miR-181a-5p/3p对OPLL细胞成骨能力的影响
【参考文献】：
期刊论文
[1]miR-144-3p在大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的表达及其靶向调控作用[J]. 陆进,张浩轩,俞鹏,龚义凤,龚喜旺,范强强,杨月. 南方医科大学学报. 2018(09)
[2]TGF-β/BMP signaling and other molecular events: regulation of osteoblastogenesis and bone formation[J]. Md Shaifur Rahman,Naznin Akhtar,Hossen Mohammad Jamil,Rajat Suvra Banik,Sikder M Asaduzzaman. Bone Research. 2015(01)
本文编号：3620251
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