甘草甜素抑制LPS诱导巨噬细胞表达和释放HMGB1的实验研究

发布时间：2017-05-18 23:09

  本文关键词：甘草甜素抑制LPS诱导巨噬细胞表达和释放HMGB1的实验研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的： 高迁移率族蛋白B1(High mobility group box-1protein,HMGB1)是在脓毒症发生发展中起中心作用的迟发炎性细胞因子，可引起脓毒症炎症反应级联放大，以其为靶分子治疗脓毒症具有广阔的治疗时间窗和良好的效果。甘草甜素(Glycyrrhizin,GL)是从传统中草药甘草中提取的一种有效成分，具有抗炎、抗病毒和免疫调节的作用，在脓毒症防治中具有潜在的诱人前景，但GL在脓毒症中的治疗作用尚罕见报道。本课题拟通过观察GL对LPS诱导的巨噬细胞表达和释放HMGB1的抑制作用，探讨GL在脓毒症中的治疗作用。 方法： 分别采用100μg/L LPS、100μg/L LPS+1mmol/L GL刺激小鼠腹腔巨噬细胞株RAW264.7，于刺激后0、4、8、12、16、20、24和48h分别收集细胞培养上清，ELISA法检测上清中HMGB1含量；提取各组培养细胞总RNA，实时荧光定量PCR检测细胞中HMGBl的mRNA表达水平；分别提取各组细胞胞浆和胞核蛋白，Western blot检测胞浆和胞核内HMGBl蛋白的含量；免疫荧光、激光共聚焦显微镜观察各组细胞内HMGB1蛋白的含量变化和分布情况。 结果： LPS组细胞于刺激后8-48h细胞内HMGB1mRNA转录水平逐渐增加，GL组细胞于刺激后8-16h HMGB1mRNA转录水平上升，与0h比较差异有显著性(P0.01)；GL组于刺激后20-48h HMGB1mRNA转录水平逐渐下降；在相同的时间点，GL组细胞HMGB1mRNA转录水平显著低于LPS组(P0.01)。 刺激前细胞胞浆HMGB1蛋白含量较少，胞核HMGB1蛋白含量较多。LPS组细胞于刺激后8-48h胞浆中HMGB1蛋白逐渐增多，GL组细胞于刺激后8-12h胞浆内HMGB1蛋白明显增加，与0h比较差异有显著性(P0.01)；GL组于刺激后16-48h胞浆内HMGB1蛋白含量降低至0h水平(P0.05)；在相同的时间点，细胞胞浆内HMGB1蛋白含量显著低于LPS组(P0.01)；LPS组和GL组细胞于刺激后8h胞核中蛋白开始增多，12-48h蛋白含量逐渐下降，与0h比较差异有显著性(P0.01)；在相同时间点，GL组胞核内HMGB1含量显著低于LPS组(P0.01)。刺激前胞核呈强HMGB1绿色荧光，胞浆荧光较弱。LPS组于刺激后8h胞核内绿色荧光开始减弱，胞浆内绿色荧光开始增强，于12-24h胞核和胞浆均可观察到逐渐增强的绿色荧光；GL组于刺激后8-12h观察到胞核HMGB1有向胞浆转位的趋势，24h胞浆内观察不到绿色荧光；在相同时间点，GL组胞核内绿色荧光强度均弱于LPS组。 LPS组和GL组细胞于刺激后8-48h培养上清中HMGB1含量逐渐上升，与0h比较差异有显著性(P0.01)；在相同时间点，GL组上清中HMGB1含量显著低于LPS组(P0.01)。 结论： 1.GL可以明显抑制LPS诱导的HMGB1的转位和释放，降低LPS刺激后细胞培养上清中HMGB1的含量。 2.GL可明显降低LPS诱导的HMGB1mRNA转录的水平，明显抑制HMGB1蛋白的合成。 目的： 本研究拟通过观察GL对LPS刺激后巨噬细胞内NF-κB和AP-1信号通路相关分子表达的影响，探讨GL抑制LPS诱导的巨噬细胞表达和释放HMGB1的具体分子机制。 方法： 分别采用100μg/L的LPS、100μg/L的LPS+1mmol/L GL刺激RAW264.7细胞，于刺激后0、4、8、12、16、20、24和48h收集细胞培养上清，ELISA检测TNF-α和IL-6含量；流式细胞仪检测细胞表面TLR4/MD2受体的表达；Western blot检测细胞中MyD88、磷酸化TAK-1、磷酸化p38MAPK、NF-κB p65的含量；免疫荧光、激光共聚焦显微镜观察细胞内NF-κB、AP-1的含量变化和分布情况。 结果： 刺激前细胞表面高表达TLR4/MD2受体；LPS组于刺激后4-8hTLR4/MD2受体表达显著下降，12-48h TLR4/MD2受体表达逐渐升高，与0h比较差异有显著性(P0.01)；GL组TLR4/MD2受体表达趋势与LPS组类似；在相同时间点，，GL组TLR4/MD2受体表达均显著低于LPS组（P0.01）。 刺激前MyD88、磷酸化TAK1和NF-κB p65蛋白表达均较低；LPS组于刺激后4-48h MyD88、磷酸化TAK1和NF-κB p65表达逐渐增高，GL组于刺激后12-48h MyD88、磷酸化TAK1和NF-κB p65表达逐渐增高，与0h比较差异有显著性(P0.01)；在相同时间点，GL组MyD88、磷酸化TAK1和NF-κB p65表达均显著低于LPS组(P0.01)；NF-κB荧光刺激前主要位于胞浆；LPS组于刺激后4-24h胞浆和胞核内NF-κB荧光逐渐增强；GL组于刺激后4-24h胞浆荧光逐渐增强，胞核荧光不明显；在相同时间点，GL组胞浆和胞核内NF-κB荧光明显弱于LPS组。 LPS组于刺激后8-48h磷酸化p38MAPK表达逐渐上升并维持在较高水平，与0h比较差异有显著性(P0.01)；GL组于刺激后4-48h磷酸化p38MAPK表达与0h无差异(P0.05)；在相同时间点，GL组磷酸化p38MAPK表达显著低于LPS组(P0.01)；刺激前AP-1亚基c-jun荧光主要位于胞核；LPS组和GL组于刺激后8-24h胞核荧光逐渐增强；在相同时间点，GL组胞核内荧光强度明显弱于LPS组。 LPS组于刺激后4-48h细胞培养上清内IL-6和TNF-α含量逐渐上升，与0h比较差异有显著性(P0.01)；GL组TNF-α和IL-6上升趋势与LPS组类似，但在相同时间点，GL组上清中IL-6和TNF-α含量较LPS组明显下降(P0.01)。 结论： 1.LPS通过TLR4/MD2→MyD88→TAK1→p38MAPK→AP-1这一信号通路诱导了HMGB1的表达和释放。GL通过抑制上述各信号通路相关分子的活性抑制了LPS诱导的HMGB1的表达和释放。 2.GL通过TLR4/MD2-NF-κB信号通路抑制了TNF-α和IL-6等早期炎症信号分子的释放，GL在后期通过抑制HMGB1的表达和释放抑制了TNF-α和IL-6的瀑布样释放。
【关键词】：甘草甜素 高迁移率族蛋白B1 抑制作用 NF-κB信号通路 高迁移率族蛋白B1 激活蛋白1
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R459.7
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照5-7
• 中文摘要7-12
• 英文摘要12-18
• 第一部分 甘草甜素对LPS诱导巨噬细胞表达和释放HMGB1的抑制作用18-40
• 前言18-19
• 1 主要试剂及实验仪器19-21
• 2 主要实验方法21-30
• 3 统计学处理30
• 4 结果30-36
• 5 讨论36-38
• 6 小结38-39
• 参考文献39-40
• 第二部分 甘草甜素抑制LPS诱导巨噬细胞表达和释放HMGB1的分子机制研究40-60
• 前言40-41
• 1 主要试剂及实验仪器41
• 2 主要实验方法41-43
• 3 统计学处理43
• 4 结果43-54
• 5 讨论54-58
• 6 小结58
• 参考文献58-60
• 文献综述60-69
• 参考文献66-69
• 致谢69-70
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文目录70-71

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 丁宁;肖慧;高巨;许立新;佘守章;;应用噬菌体展示技术筛选HMGB1启动子结合蛋白[J];中国病理生理杂志;2010年01期

  本文关键词：甘草甜素抑制LPS诱导巨噬细胞表达和释放HMGB1的实验研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：377316