Smurf2对增生性瘢痕TGF-β1信号通路负向调节因子Smad7的影响及其机制的研究

发布时间：2017-06-10 11:23

  本文关键词：Smurf2对增生性瘢痕TGF-β1信号通路负向调节因子Smad7的影响及其机制的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景创伤修复过程中成纤维细胞过度增殖，大量分泌细胞外基质（ECM)，以及ECM合成与降解失衡等促进了增生性瘢痕的形成。转化生长因子β1（Transforming growth factorβ1，TGF-β1）在这一病理过程中起着重要作用。TGF-β1主要通过细胞内Smads蛋白传递信号，其信号转导过程在不同层面上受到多种多样精确的调控。其中，抑制性Smad蛋白Smad7是TGF-β1/Smad信号通路的主要负向调节因子之一。 泛素-蛋白酶体途径（Ubiquitin Proteasome Pathway，UPP）是真核细胞中蛋白质选择性降解的重要途径，广泛参与如细胞周期、DNA修复、信号转导、转录调节、吞噬等生理过程，其功能的异常与多种疾病相关。泛素-蛋白酶体途径包括泛素蛋白，泛素激活酶E1、泛素结合酶E2、泛素连接酶E3及26S蛋白酶体。其中，E3泛素连接酶特异性地识别靶蛋白底物，进而引发蛋白酶体降解蛋白质，在蛋白质泛素化降解的过程中起着极其重要的作用。 在TGF-β1/Smad信号传导通路中，E3泛素连接酶通过选择性介导其关键组分如Smads蛋白、TGF-β受体等的泛素化降解，在TGF-β1/Smad信号活性的调节中起枢纽作用，一旦功能失调，会导致异常的TGF-β1/Smad信号传导，并引起一系列疾病的病理生理学改变。Smurf2（Smad ubiquitination regulatory factor2，Smad泛素化调节因子2）是E3泛素连接酶的一种，含HECT结构域。最近研究报道，Smurf2在多种纤维化疾病中表达异常，通过泛素化降解Smad7、核转录抑制因子SnoN（Ski-related novel gene N）、Ski（Sloan-KetteringInstitute proto-oncogene）等影响了TGF-β1信号传导通路，参与了纤维化疾病的发生、发展。 最近，我们的研究显示：增生性瘢痕组织中Smurf2的表达增强，使用siRNA成功抑制增生性瘢痕成纤维细胞Smurf2的表达后，瘢痕成纤维细胞自分泌TGF-β1减少、I型胶原的合成减少、a-SMA的表达减少，提示Smurf2表达增强与增生性瘢痕的发生、发展有关。但是，在增生性瘢痕中，Smurf2是通过作用于哪一种信号分子来调节TGF-β1信号转导，，尚不清楚。本研究探索E3泛素连接酶Smurf2是否通过降解TGF-β1/Smad信号通路的负向调节蛋白Smad7，从而增强TGF-β1信号的转导，参与了增生性瘢痕的形成。目的探讨Smurf2对增生性瘢痕成纤维细胞TGF-β1/Smad信号转导通路负向调节因子Smad7的影响及调控机制。 方法（1）以增生性瘢痕成纤维细胞为研究对象，同一个体正常皮肤成纤维细胞作为对照，采用Western Blot检测两组细胞中Smad7的蛋白表达水平；（2）加入外源性TGF-β1（10ng/ml）作用5min、15min、30min、1h、2h、12h后，采用RT-PCR和Western Blot分别检测增生性瘢痕成纤维细胞与正常皮肤成纤维细胞中Smad7的mRNA和蛋白表达水平；（3）收集增生性瘢痕成纤维细胞和正常皮肤成纤维细胞的细胞裂解液，分别加入泛素化混合物于37℃孵育1h、2h、6h，采用Western Blot检测两组细胞中Smad7的体外降解水平；（4）收集增生性瘢痕成纤维细胞和正常皮肤成纤维细胞的细胞裂解液，同时加入泛素化混合物及蛋白酶体抑制剂MG132/MG115（50μM/50μM），研究其对Smad7体外降解的抑制作用；（5）利用免疫共沉淀技术，研究增生性瘢痕成纤维细胞中Smad7与E3泛素连接酶Smurf2是否存在相互作用；（6）采用siRNA干扰技术沉默增生性瘢痕成纤维细胞中Smurf2的基因表达，研究沉默Smurf2后，增生性瘢痕成纤维细胞中Smad7蛋白在TGF-β1刺激下的表达水平。 结果（1）在正常皮肤及增生性瘢痕成纤维细胞中，Smad7的蛋白表达水平无明显差异；（2）在外源性TGF-β1刺激下，正常皮肤成纤维细胞中Smad7mRNA和蛋白表达水平均呈时间依赖性增高，增生性瘢痕成纤维细胞中Smad7mRNA表达呈时间依赖性增加，蛋白水平无明显变化；（3）正常皮肤成纤维细胞中，Smad7的体外降解无明显变化，增生性瘢痕成纤维细胞中，Smad7的体外降解增强；（4）蛋白酶体抑制剂MG132/MG115可以阻断增生性瘢痕成纤维细胞中Smad7的体外降解；（5）在用Smurf2抗体免疫共沉淀下来的蛋白复合物中检测到Smad7，表明增生性瘢痕成纤维细胞中Smurf2与Smad7存在相互作用；（6）增生性瘢痕成纤维细胞中，加入TGF-β1刺激，Smad7的蛋白表达水平无明显变化；沉默Smurf2基因后，Smad7蛋白在TGF-β1刺激下表达增高。 结论在增生性瘢痕成纤维细胞中，Smurf2可能通过泛素化降解Smad7，削弱了Smad7对TGF-β1信号转导的抑制作用，从而增强了TGF-β1/Smad信号转导，促进了增生性瘢痕的形成。
【关键词】：Smurf2 Smad7 转化生长因子β1 增生性瘢痕
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R641
【目录】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-8
• 目录8-9
• 第一章 前言9-12
• 第二章 实验方法和材料12-26
• 2.1 实验样本12
• 2.2 试剂、耗材及仪器12-18
• 2.3 实验方法18-25
• 2.4 统计学处理25-26
• 第三章 实验结果26-36
• 3.1 成纤维细胞生长的特点26-27
• 3.2 增生性瘢痕成纤维细胞中 Smad7 蛋白的表达27-28
• 3.3 TGF-β1 刺激下增生性瘢痕成纤维细胞中 Smad7 的表达28-30
• 3.4 增生性瘢痕成纤维细胞中 Smad7 的体外降解30-31
• 3.5 蛋白酶体抑制剂 MG132 / MG115 对 Smad7 体外降解的抑制31-32
• 3.6 免疫共沉淀检测 Smurf2 与 Smad7 的相互作用32-33
• 3.7 siRNA 沉默 Smurf2 基因表达后增生性瘢痕成纤维细胞中 Smad7 的表达33-36
• 第四章 讨论36-43
• 4.1 TGF-β1/Smad 信号通路与创面愈合及增生性瘢痕形成36-38
• 4.2 蛋白质的泛素化降解与疾病38-39
• 4.3 E3 泛素连接酶 Smurf2 对 TGF-β1/Smad 信号转导的调控39-41
• 4.4 结论41-42
• 4.5 意义42-43
• 参考文献43-49
• 中英文缩略词对照表49-50
• 攻读期间所获成果50-51
• 致谢51

【参考文献】

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本文编号：438350