内皮源性一氧化氮合酶基因多态性与脂多糖诱导血管内皮细胞损伤异质性关系的研究

发布时间：2017-06-25 06:10

  本文关键词：内皮源性一氧化氮合酶基因多态性与脂多糖诱导血管内皮细胞损伤异质性关系的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：研究内皮源性一氧化氮合酶（eNOS）基因多态性对eNOS表达、一氧化氮（NO）合成的影响，以及与脂多糖（LPS）诱导原代人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）活化、损伤异质性的关系。方法： HUVEC体外传代培养，采用PCR扩增目的片段、运用酶切及电泳分离手段进行基因多态性分析并进行测序鉴定。采用RT-PCR、Western Blot、ELISA及比色法等实验技术，，研究生理盐水和LPS刺激下不同eNOS基因型HUVEC eNOS mRNA和蛋白质的表达、一氧化氮（NO）的合成；炎症介质肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）的分泌；以及内皮细胞损伤标记物血管假性血友病因子（vWF）、血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)、血管内皮钙粘蛋白质（VE-cadherin）的表达。结果：（1）eNOS894G→T基因型GG、GT、TT基因频率分别为181／222（81.5%）、38/222(17.1％)和3/222(1.4%)；eNOS内含子4ab VNTR基因型aa、ab、bb基因型频率分别为3/274(1.1%)、35/274(12.8%)和236／274（86.1%）。三种优势基因型单体为：GG／bb(67.3％), GT/bb(17.1%),和GG/ab(15.2%)。（2）与基因型GG比较，基因型GT eNOS mRNA、蛋白质基础表达值低且NO合成少。LPS刺激后，两种基因型eNOS的表达和NO合成均显著下降，但基因型GT下降幅度更加显著（p0.05）。基因型GT HUVEC分泌TNF-α、IL-6和表达vWF、VCAM-1基础值显著高于、而VE-cadherin基础表达水平显著低于基因型GG细胞。LPS刺激后，两种基因型HUVEC分泌TNF-α、IL-6和表达vWF、VCAM-1、VE-Cadherin水平与基础值比较均有显著差异。但GT型细胞IL-6升高的幅度显著高于GG型细胞（p0.05）。eNOS内含子4ab VNTR基因型ab与bb对eNOS mRNA、蛋白质表达和NO合成；炎症介质TNF-α、IL-6分泌及表达血管内皮损伤标志物vWF、VCAM-1和VE-Cadherin水平的影响也呈现与eNOS894GG、GT基因型相似的基础水平和LPS刺激后的异质性变化。三种基因型单体中，GT/bb单体eNOS表达和NO合成的基础值最低（p0.05）。LPS刺激后，该单体受影响更加显著，而且引起炎症介质（TNF-α、IL-6）的释放和血管内皮损伤标志物（vWF、VCAM-1）表达的升高幅度更大、细胞结构完整性标志物VE-Cadherin更加显著地降低。结论：eNOS894G→T和内含子4ab VNTR基因多态性均影响原代HUVEC eNOS表达和NO合成。eNOS894GT、eNOS4bb基因型以及eNOS GT/4bb基因单体HUVEC eNOS基础表达水平低，在LPS刺激下，与其它基因型和基因单体HUVEC比较，eNOS表达和NO合成减少的程度更加显著，可能是导致LPS诱导HUVEC活化和损伤异质性的重要因素。
【关键词】：人脐静脉内皮细胞 内皮源性一氧化氮合酶 基因多态性 内皮细胞损
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R459.7
【目录】：

• 目录4-6
• 中文摘要6-8
• Abstract8-10
• 英文缩略索引10-11
• 前言11-14
• 1. 课题研究背景14-15
• 2. 研究方法15-16
• 3. 技术路线图16-17
• 4. 实验材料17-20
• 4.1 标本17
• 4.2 主要仪器设备17-18
• 4.3 主要试剂与耗材18-19
• 4.4 主要溶液的配制19-20
• 5. 主要操作技术流程20-28
• 5.1 HUVEC 体外培养步骤20-21
• 5.2 HUVEC 的 DNA 提取21-22
• 5.3 HUVEC 的 RNA 提取22-23
• 5.4 HUVEC 的蛋白质提取23
• 5.5 HUVEC 蛋白质的定量23-24
• 5.6 Western-blot 检测 HUVEC 蛋白质的表达24-27
• 5.7 检测 HUVEC NO 含量27
• 5.8 检测 HUVEC TNF-α、IL-6、vWF、VCAM-1 的表达27-28
• 6. 统计学处理28-29
• 7. HUVEC 原代培养鉴定、eNOS 基因型鉴定及基因多态性分析29-34
• 7.1 实验步骤29-30
• 7.2 实验结果30-34
• 8. eNOS 基因多态性与 HUVEC eNOS 表达、NO 合成、炎症介质释放以及细胞损伤标志物表达的关系34-64
• 8.1 实验设计34-36
• 8.2 实验分组36-37
• 8.3 实验结果37-64
• 8.3.1 eNOS 894G→T 基因多态性与 HUVEC eNOS 表达、NO 合成、炎性介质释放以及细胞损伤标志物表达的关系37-46
• 8.3.2 eNOS 内含子 4a/b VNTR 基因多态性与 HUVEC eNOS 表达、NO 成、炎性介质释放以及细胞损伤标志物表达的关系46-55
• 8.3.3 eNOS 894G→T4a/b VNTR 基因单体多态性与 HUVEC eNOS 表达、NO 合成、炎性介质释放及细胞损伤标志物表达的关系55-64
• 9. 讨论64-67
• 10. 结论67-69
• 参考文献69-76
• 文献综述76-84
• 摘要76
• eNOS 基因定位及结构表达76-77
• eNOS 基因多态性及表达77-78
• eNOS 基因多态性与脓毒症78-79
• 参考文献79-84
• 攻读学位期间发表文章情况84-85
• 致谢85-86
• 基金项目86-87

【共引文献】

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本文编号：481044