VEGI调节颅脑创伤后脑水肿的实验研究

发布时间：2017-06-29 14:20

  本文关键词：VEGI调节颅脑创伤后脑水肿的实验研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究目的： 1、通过观察VEGI (Vascular Endothelial Growth Inhibitor)在创伤性脑损伤(Traumatic Brain Injury, TBI)后小鼠的血脑屏障调控作用,脑水肿抑制作用,以及神经功能的恢复改善情况,明确其在脑创伤的功能作用,并初步探讨其潜在作用机制。 2、通过观察VEGI在VEGF-A (Vascular Endothelial Growth Factor A)所诱导的体外血脑屏障(Blood Brain Barrier, BBB)模型渗漏的抑制作用,上调紧密连接蛋白作用,并在形态学上进行确认,明确VEGI能够抑制VEGFR2受体的磷酸化从而抑制VEGF-A所造成的BBB渗漏,并初步探讨其在细胞水平的作用机制。 研究方法： 1、体内试验部分：本实验选用清洁级健康成年C57B1/6小鼠,随机分为实验组1(空白对照组)、实验组2(假手术组)、实验组3(单纯TBI组)和实验组4(TBI+VEGI组)。分组后,我们建立小鼠液压打击颅脑创伤模型,应用小鼠神经功能评分和Morris水迷宫评价其行为学功能,并应用尹文思蓝、免疫荧光技术对小鼠血脑屏障的渗漏、紧密连接蛋白、血管标记进行检测。 2、体外实验部分：本实验利用C57小鼠的鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3构建体外血脑屏障模型,随机分为实验组1(空白对照组)、实验组2(VEGI组)、实验组3(VEGF-A组)和实验组4(VEGF-A+VEGI组)。分组后,我们利用所构建的血脑屏障模型,测量细胞的跨膜电阻值检测血脑屏障渗漏的程度,并利用免疫荧光技术、Western Blot技术测定紧密连接蛋白的表达程度,并利用跳跃探针式离子电导显微镜(Hopping Probe Ion Conductance Microscopy, HPICM)连续实时观测紧密连接的纳米级形态学变化。 研究结果： 1、体内试验部分：液压打击后,实验组3和实验组4的小鼠在遭受液压打击后,mNSS评分立即升高,在伤后12小时,两组间评分无统计学差异,但随着伤情的逐渐恢复,差异渐渐呈现。在伤后24小时,遭受创伤的实验组3小鼠评分高于实验组4(P0.01),这种差异在受伤后的第7天消失。Morris水迷宫定位航行测试中,实验组3和实验组4中,TBI组的小鼠于第三天开始,与假手术组相比较出现了统计学差异,这种差异一直保持至第五天训练结束；Morris水迷宫空间探索测试中,实验组3和实验组4与实验组1和实验组2相比较之间存在着明显的统计学差异,其目标象限百分比均明显下降(P0.01),实验组3和实验组4相比较也出现明显的统计学差异(P0.01)。实验组3相比较实验组4的EB渗漏率明显更低(P0.01)。免疫荧光也显示实验组3与实验组4之间,CLN5、Alb的表达存在统计学差异(P0.01)。 2、体外实验部分：体外培养的bEnd.3细胞得TEER (Ω·cm2)的所测值中,对照组、VEGI预处理组以及VEGI+VEGF组之间未见明显统计学差异,而VEGF组相对于对照组明显下降(P0.01)。在HPICM连续24h观测中,空白对照组、VEGI预处理组、VEGI+VEGF组的bEnd.3细胞形态以及细胞间紧密连接基本未发生明显的形态学变化,然而VEGF组却在加入100ng/ml VEGF-A之后16h逐渐出现了紧密连接高度的降低,并随时间的推移这种高度的降低更加明显；并且,这种变化还体现在相对粗糙度的变化上(P0.01)。免疫荧光检测中发现：VEGF-A可明显降低Claudin-5的表达(P0.01),但这种抑制作用可被VEGI所抑制。在Western Blot检测中,可见,100ng/ml VEGF-A可明显降低Claudin-5、 Occlaudin的表达(P0.01),但未对ZO-1的表达造成任何统计学上的差异。并且,相对于VEGF-A组,VEGI+VEGF-A组可明显抑制VEGF-A对Claudin-5、 Occlaudin的下调作用；VEGFR2上的pY1175位点的磷酸化可被VEGF-A激活,但VEGI对这种VEGF-A诱导的磷酸化具有抑制作用。 研究结论： 1、在体实验：VEGI可以抑制TBI后小鼠的继发性脑水肿、减轻血脑屏障的渗漏、上调紧密连接蛋白,发挥神经保护作用,从而改善小鼠脑神经功能及行为学指标,为开发VEGI治疗TBI后脑水肿提供了实验依据。 2、体外实验：VEGI可以抑制VEGF-A所诱导的BBB体外模型的渗漏、上调紧密连接蛋白,我们首次利用HPICM观测到了bEND.3在VEGI/VEGF-A的作用下所表现的纳米级形态学变化,此外,我们还发现了VEGI能够抑制VEGFR2受体的磷酸化,为探索VEGI对血管内皮细胞的作用机制进行了探索。
【关键词】：创伤性脑损伤 VEGI 血脑屏障 HPICM VEGF-A 神经保护
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R651.15
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• ~.略语/符号说明11-12
• 前言12-18
• 研究现状、成果12-15
• 研究目的、方法15-18
• 第一部分 VEGI改善TBI小鼠脑血管功能障碍机制的体内研究18-34
• 1. 实验材料18-20
• 1.1 实验动物18
• 1.2 主要试验装置18-20
• 2. 实验方法20-27
• 2.1 建立小鼠颅脑创伤液压打击模型20-21
• 2.2 VEGI制备及注射剂量21-22
• 2.3 mNSS评分评价小鼠液压打击后行为学损害22-23
• 2.4 Morris水迷宫检测小鼠认知功能23-24
• 2.5 测定小鼠脑损伤后EB渗透率24-25
• 2.6 小鼠脑组织冰冻切片的制备及免疫荧光染色25-27
• 2.7 统计学处理27
• 3. 结果27-34
• 3.1 mNSS小鼠神经功能评测行为学差异27-28
• 3.2 Morris水迷宫检测小鼠学习认知能力28-30
• 3.3 TBI后小鼠Evans Blue渗透率30-31
• 3.4 TBI后小鼠免疫荧光31-34
• 第二部分 ：VEGI改善VEGF-A所致血脑屏障渗漏的体外研究34-49
• 1. 实验材料34-38
• 1.1 细胞来源34-35
• 1.2 主要试验装置35-38
• 2. 实验方法38-45
• 2.1 细胞培养38-39
• 2.2 跨膜电阻值(TEER)的测量39
• 2.3 跳跃探针式离子电导显微镜技术39-40
• 2.4 细胞免疫荧光染色40-41
• 2.5 Western Blot检测41-45
• 2.6 统计学方法45
• 3. 结果45-49
• 3.1 体外培养bEND.3 细胞跨膜电阻值(TEER)的测量45-46
• 3.2 体外培养bEND.3 细胞跳跃探针式离子电导显微镜技术检测46-47
• 3.3 体外培养bEND.3 细胞免疫荧光检测47-48
• 3.4 体外培养bEND.3 细胞Western Blot检测48-49
• 讨论49-54
• 结论54-55
• 参考文献55-61
• 发表论文和参加科研情况说明61-62
• 综述62-77
• 综述参考文献73-77
• 致谢77

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