Tim-3在脓毒血症中的免疫调节及其机制研究

发布时间：2017-06-29 14:16

  本文关键词：Tim-3在脓毒血症中的免疫调节及其机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景:T细胞免疫球蛋白粘附分子-3（T cell Ig and mucin domain protein3,Tim-3）最初被发现于活化的Th1、Th17、Tc1效应细胞上，与其天然配体半乳糖结合蛋白-9（Galectin-9，Gal-9）结合后可诱导T效应细胞的凋亡，下调免疫反应，诱导免疫耐受。然而随着研究的深入，人们发现Tim-3也表达在DC、巨噬细胞等天然免疫细胞上，并参与天然免疫的调节。由于Tim-3在天然免疫和适应性免疫反应中均具有重要的作用，所以它的表达失调与很多临床疾病相关。Tim-3的低表达与T细胞功能增强的自身免疫性疾病有关，如多发性硬化和自身免疫性肝炎；Tim-3的过表达与T细胞功能丧失相关的疾病有关，如肿瘤或慢性细菌性感染。脓毒血症是由感染诱发的全身性过度炎症反应。据统计全球每年有1800万人发病，在非休克患者中，其死亡率为30％—40％，而在休克患者中其死亡率则高达70%—90%。即便在发达国家如美国，一年就有近25万脓毒血症死亡病例。脓毒血症发病率仍存在上升的趋势，，但目前尚缺乏有效的诊治手段。另外有越来越多的数据显示，参与天然免疫反应的Tim-3具有免疫自稳调节的功能。Tim-3是否能够促进脓毒血症的免疫自稳，成为治疗脓毒血症的新措施，目前还不清楚。 目的:Tim-3在天然免疫和适应性免疫应答中起非常重要的免疫调节作用，探究该分子在脓毒血症中的可能免疫调节作用及其机制。 方法:1、收集脓毒血症患者血标本，观察不同病情患者Tim-3表达情况；构建经典脓毒血症动物模型—盲肠结扎穿刺术，观察模型发病过程中Tim-3的动态变化；给予Tim-3单抗或者Tim-3融合蛋白，观察Tim-3通路阻断后，CLP生存率和脾脏细胞因子变化情况。2、观察Tim-3单抗对CLP腹腔巨噬表达细胞细胞因子的影响；观察CLP不同严重程度时，腹腔巨噬细胞表达Tim-3情况；观察稳定低/高表达Tim-3RAW264.7细胞系的吞噬能力及其对TLRs激动剂的反应性。3、检测RAW264.7细胞系/小鼠腹腔巨噬细胞受到不同浓度LPS或不同时间点LPS刺激后，Tim-3表达情况； Tim-3单抗对LPS模型脾脏细胞因子的影响；Tim-3单抗对TLR4-KO-CLP的生存率和脾脏细胞因子影响。 结果:1、与轻度脓毒血症患者相比，重症患者外周血中表达Tim-3下降；CLP模型随着时间的延长，Tim-3表达呈先升高后下降的趋势，并且与sham相比，CLP小鼠Tim-3表达下降；给予Tim-3单抗或者Tim-3融合蛋白，Tim-3通路阻断，CLP生存率下降，脾脏细胞因子（IL-1β、IL-6、TLR4等）均呈现上升趋势。2、Tim-3单抗阻断CLP体内Tim-3通路后， CLP腹腔巨噬表达细胞细胞因子呈升高趋势；与sham相比，CLP小鼠腹腔巨噬细胞表达Tim-3下降；观察稳定低/高表达Tim-3RAW264.7细胞系的吞噬能力及其对TLRs激动剂的反应性，发现Tim-3表达下降时细胞系的吞噬能力提高，对TLRs的反应性升高，Tim-3表达升高时变化相反。3、检测RAW264.7细胞系受到不同浓度LPS或不同时间点LPS刺激后，Tim-3表达呈双向趋势，小鼠腹腔巨噬细胞受到不同LPS刺激后，随着LPS浓度升高Tim-3表达下降；LPS模型时， Tim-3单抗阻断Tim-3通路后，脾脏细胞因子呈升高趋势； Tim-3单抗对TLR4-KO-CLP的生存率和脾脏细胞因子没有明显影响。 结论:Tim-3低表达或者Tim-3通路的阻断后脓毒血症病情加重。因此Tim-3可能在维持脓毒血症的免疫自稳机制中发挥了一定的作用。另外，巨噬细胞的过度活化能够导致脓毒血症的系统性炎症反应。当阻断Tim-3通路或者低表达Tim-3时，巨噬细胞的活化程度却能够明显增强；当巨噬细胞高表达Tim-3时，该细胞上TLRs介导的促炎因子的合成明显受到抑制，这表明Tim-3是TLRs介导的免疫反应的负调控因子。TLR4与Tim-3通路具有相互抑制的作用， TLR4是Tim-3负调控反应中重要的调节因子。因此，Tim-3通过抑制TLR4反应维持脓毒血症的免疫自稳。
【关键词】：Tim-3 脓毒血症 TLR4 巨噬细胞 负调控
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R459.7
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-9
• 缩略词表9-10
• 目录10-13
• 引言13-17
• 第一部分 Tim-3 在脓毒血症中的表达17-31
• 1.1 引言17
• 1.2 材料与设备17-18
• 1.2.1 实验动物17
• 1.2.2 试剂17
• 1.2.3 设备17-18
• 1.3 方法18-23
• 1.3.1 麻醉药的配置18
• 1.3.2 建立小鼠脓毒血症模型18
• 1.3.3 取小鼠腹腔灌洗液18-19
• 1.3.4 取小鼠脾淋巴细胞19
• 1.3.5 除蛋白中的内毒素19
• 1.3.6 蛋白定量（按照 BCA 蛋白定量试剂盒操作）19-20
• 1.3.7 细胞总 RNA 提取步骤20
• 1.3.8 反转录步骤20-21
• 1.3.9 实时定量 PCR 步骤21
• 1.3.10 引物序列21-22
• 1.3.11 ELISA （检测依据细胞因子检测试剂盒说明书）22-23
• 1.3.12 统计学处理23
• 1.4 结果23-29
• 1.4.1 Tim-3 在脓毒血症中的表达23-26
• 1.4.2 Tim-3 参与脓毒血症的病理过程26-29
• 1.5 讨论29-31
• 第二部分 Tim-3 在脓毒血症中的作用机制研究（一）31-41
• 2.1 引言31
• 2.2 材料与设备31-32
• 2.2.1 细胞系31
• 2.2.2 试剂31
• 2.2.3 设备31-32
• 2.3 方法32-33
• 2.3.1 细胞培养32
• 2.3.2 细胞的冻存32
• 2.3.3 巨噬细胞的分选32
• 2.3.4 Tim-3 通路阻断对 CLP 脾脏巨噬细胞细胞因子影响实验32-33
• 2.3.5 腹腔巨噬细胞吞噬能力检测33
• 2.3.6 统计学处理33
• 2.4 结果33-37
• 2.4.1 阻断 Tim-3 通路或者 Tim-3 的低表达能增强巨噬细胞反应33-36
• 2.4.2 过表达 Tim-3 的巨噬细胞能够抑制 TLRs 诱导的促炎因子的产生36-37
• 2.5 讨论37-41
• 第三部分 Tim-3 在脓毒血症中的作用机制研究（二）41-51
• 3.1 引言41
• 3.2 材料41
• 3.2.1 实验动物41
• 3.2.2 试剂41
• 3.2.3 设备41
• 3.3 方法41-43
• 3.3.1 内毒素血症模型的构建41-42
• 3.3.2 小鼠的饲养和繁殖42
• 3.3.3 小鼠尾部基因组 DNA 的提取42-43
• 3.3.4 PCR 反应43
• 3.3.5 琼脂糖凝胶电泳鉴定43
• 3.4 结果43-48
• 3.4.1 TLR4 参与了 Tim-3 介导的反应43-45
• 3.4.2 Tim-3 能够通过抑制 TLR4 反应，维持机体的免疫自稳45-46
• 3.4.3 小鼠的繁殖情况及其基因型鉴定结果46-47
• 3.4.4 阻断 TLR4-KO 小鼠上 Tim-3 通路不能明显影响脓毒血症的病理过程47-48
• 3.5 讨论48-51
• 参考文献51-53
• 综述53-60
• 参考文献57-60
• 硕士期间获得成果60-62
• 致谢62-65
• 发表文章65-80

【共引文献】

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1 李曼;陆林;沈卫峰;;高迁移率族蛋白B1与心血管疾病关系的研究进展[J];国际心血管病杂志;2013年04期

2 翟振丽;马维红;李全忠;申炜;阳跃忠;;载脂蛋白A1诱导骨髓源性巨噬细胞向抗炎性M2型极化的作用[J];中国动脉硬化杂志;2013年10期

3 单小鸥;李昌崇;;105例社区获得性儿童败血症病原学及体外耐药分析[J];中华医院感染学杂志;2008年05期

4 宋振举;郦珊珊;童朝阳;孙湛;姚晨玲;黄培志;;脓毒症患者血清炎症/抗炎症细胞因子浓度与预后的相关性研究[J];中国急救医学;2008年09期

5 徐磊磊;周义军;宋兴华;丁俐文;陈江涛;王

本文编号：498191