水母毒素致肾脏损伤的机制研究

发布时间：2017-07-16 05:05

  本文关键词：水母毒素致肾脏损伤的机制研究

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【摘要】：近年来，包括中国近海水域在内的全球许多海域都出现了水母暴发现象。同时，人类涉海活动逐渐增多，水母蜇伤成为最常见的海洋生物伤。水母通过发射刺丝注入毒液来捕食和进行防御，蜇伤人或动物。文献报道，人类被水母蜇伤后，会出现皮肤过敏、疼痛甚至心肺衰竭。研究表明水母毒素能够导致严重的局部和全身性疾病，严重时还可致人死亡。日益多发的水母蜇伤事件引起沿海渔民和游客的恐慌。 发形霞水母（Cyanea capillata）毒性相对比较温和，未见致死病例报道，但其在我国近海广泛分布，是我国东南海域主要的致伤水母之一。水母蜇伤后，有一部分患者出现迟发的多器官功能损伤，本课题组在前期研究中也发现发形霞水母触手提取物（tentacle extract, TE）能够诱导模型动物的肾脏损伤。我们发现TE作用后，大鼠肾脏皮质部分肾小球囊腔以及肾小管腔内出现大量空泡及透明质样物质，肾髓质血管床大量开放，肾小管上皮细胞脱落坏死，进一步电镜观察发现，肾小球滤过膜无明显变化，肾小管上皮细胞损伤严重，但具体的损伤机制尚不明确。因此本课题以损伤最为严重的肾小管上皮细胞为主要研究对象，探索TE对肾脏特别是肾小管上皮细胞的毒性作用机制。本文第一部分重点研究TE对大鼠肾脏的损伤机制，第二部分重点研究膜保护剂聚乙二醇（PEG）对肾细胞损伤的干预效果。 方法 第一部分：发形霞水母触手提取物致大鼠肾脏损伤的机制研究 制作水母毒素迟发性脏器损伤大鼠模型，取其肾脏标本，用TUNEL法检测大鼠肾脏组织细胞的凋亡，并用免疫组化方法检测肾脏中Caspase-3表达。利用MTT法检测不同浓度TE对大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E存活率的影响，并用共聚焦显微镜观察细胞形态的变化。使用Annexin V-FITC/PI双染法在流式细胞仪上检测细胞凋亡。通过双向电泳筛选膜上差异蛋白和激光共聚焦测定胞浆Ca2+浓度的变化来说明细胞凋亡膜受体通路在肾细胞损伤中的作用。通过蛋白免疫印迹法测定凋亡相关分子的表达，，并利用激光共聚焦显微镜检测线粒体膜电位和活性氧（ROS）的改变，结合TBA比色法检测氧化指标MDA来明确细胞凋亡线粒体通路在肾小管细胞损伤中的作用。 第二部分：聚乙二醇（PEG）对TE导致肾小管上皮细胞损伤的干预效果 在PEG6000的干预下，用TE刺激细胞。MTT法检测PEG6000对NRK-52E细胞生存率的干预效果，用共聚焦显微镜观察细胞形态，用Annexin V-FITC/PI双染法在流式细胞仪上检测细胞凋亡，利用激光共聚焦显微镜检测线粒体膜电位和ROS水平，TBA比色法检测MDA水平。 结果 第一部分：发形霞水母触手提取物致大鼠肾脏损伤的机制研究 与正常大鼠肾脏对照，水母毒素延迟毒性综合征模型大鼠的肾脏切片Tunel染色观察到大量棕黄色凋亡细胞及细胞碎片，且Caspase-3的表达升高。TE对NRK-52E细胞的毒性具有时间和剂量依赖性，细胞在TE作用下会出现皱缩等形态变化。TE浓度越大，凋亡与坏死的细胞越多。双向电泳未筛选到TE作用前后细胞膜上的差异蛋白。TE能够使胞浆内钙离子浓度升高，常用的钙拮抗剂不能抑制这一现象。PEG6000对于TE引起的NRK-52E和HEK-293（人胚胎肾细胞）胞内钙升高都有显著的抑制作用。TE作用后，NRK-52E细胞Caspase-8,-9,-3表达升高，ROS与MDA水平升高，线粒体膜电位降低。 第二部分：聚乙二醇（PEG）对TE导致肾小管上皮细胞损伤的干预效果 在浓度为25mM的PEG6000干预下，TE不引起NRK-52E细胞形态明显变化，且细胞存活率显著提高。PEG6000能够缓解细胞的凋亡与坏死，抑制TE引起的细胞ROS与MDA水平升高，维持线粒体膜电位。 结论 TE引起肾小管上皮细胞胞内Ca2+超载的来源是细胞外钙内流，且外钙内流的途径并不是已知的膜上钙通道，而是通过水母毒素在细胞膜上形成的孔道。孔道形成能够引起大量钠离子、钙离子内流，钾离子从细胞内流出，改变细胞渗透压，引起线粒体膜电位降低，胞内活性氧堆积，触发线粒体途径的细胞凋亡。 膜促融剂PEG6000能够从上游干预孔道的形成，从而抑制钙超载、活性氧簇堆积等下游反应，对水母毒素的损伤效应起到保护作用。
【关键词】：水母 触手提取物 孔道形成 凋亡 线粒体
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R646
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-10
• 英文缩写词10-11
• 前言11-13
• 第一部分 发形霞水母触手提取物致大鼠肾脏损伤的机制研究13-48
• 一、前言13
• 二、材料和方法13-27
• 三、实验结果27-46
• 四、讨论46-48
• 第二部分 聚乙二醇对 TE 导致肾小管上皮细胞损伤的干预效果48-58
• 一、前言48
• 二、材料和方法48-50
• 三、实验结果50-56
• 四、讨论56-58
• 全文总结58-59
• 参考文献59-62
• 文献综述62-72
• 参考文献69-72
• 附录72-74
• 致谢74-75

【参考文献】

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1 刘伟,王娟,姜孝玉,杨文利,徐安龙;海葵溶细胞素的研究进展[J];海洋科学;2005年04期

2 孙晓霞;王世伟;孙松;;Introduction to the China Jellyfish Project——The Key Processes,Mechanism and Ecological Consequences of Jellyfish Bloom in China Coastal Waters[J];Chinese Journal of Oceanology and Limnology;2011年02期

本文编号：547142