ILK在SD大鼠皮肤烧伤创面愈合过程中的作用

发布时间：2017-08-06 00:03

  本文关键词：ILK在SD大鼠皮肤烧伤创面愈合过程中的作用

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【摘要】：研究背景： 随着社会人口老龄化趋势增长，糖尿病溃疡、放射性溃疡、压力性溃疡等慢性创面发病率明显增加。因此，创面愈合已经成为现代医学研究重点之一。创面愈合是局部组织的再生，涉及到表皮结构再生和真皮组织重构的复杂生物学过程。目前，创面愈合确切机制尚未明确，组织修复的效果尚不能令人满意。有关创面愈合分子机制已成为学者们关注的热点。进一步深入研究创面愈合分子机制，有利于拓展创面治疗的思路和手段，对提高创面愈合的速度和质量具有积极意义。 整合素连接激酶（integrin-linked kinase，ILK）是一种组织器官广泛表达的丝氨酸/苏氨酸激酶。它介导PKB/AKT、Wnt、LEF-1和β-catenin等多种细胞信号通路调控，对细胞的迁移、增殖、分化和凋亡等生物学功能起重要作用，并介导细胞-细胞及细胞与细胞外基质（extracellular matrix，ECM）之间的相互作用。国内外最新研究发现ILK在维持皮肤真皮稳态方面发挥重要作用，是损伤修复必不可少的细胞应答组成部分[1-2]。本课题前期研究在细胞水平发现ILK能够通过AKT下游信号通路参与成纤维细胞（fibroblast，Fb）的迁移、分化、增殖、凋亡，影响创面愈合，同时也发现ILK与大鼠烧伤创面愈合有高度相关性，但ILK对烧伤创面愈合的作用机制还需进一步探讨。 本研究以大鼠皮肤深Ⅱ°烧伤创面为模型，利用ILK重组慢病毒技术转染大鼠创面周围，上调ILK表达；同时使用ILK特异性抑制剂QLT0267抑制ILK活性，观察ILK在创面愈合过程中的作用以及与Fn、I型胶原、α-SMA和AKT磷酸化的关系，这将有助于完善创面愈合的分子生物学理论，为创面分子水平和基因治疗提供新思路。 第一部分烧伤创面动物模型的制备 目的制备稳定准确的大鼠烧伤创面模型。 方法20只SD大鼠随机分为4组，采用恒温恒压烫伤仪分别致伤4、6、8、10s，致伤过程以底面积2.5cm2、质量0.5kg的80℃圆柱形烫头垂直接触大鼠脊柱左右两侧对称皮肤，24h后采集各组大鼠的创面组织行病理组织学检查，根据病理结果筛选出深Ⅱ°创面的致伤时间，制备大鼠皮肤烧伤创面模型。 结果根据病理切片检查证实8s烫伤的实验创面为深Ⅱ°烧伤创面。 结论应用YLS-5Q型烫伤仪底面积2.5cm2、质量0.5kg、烫头温度80℃、作用时间8s致伤大鼠背部皮肤，可制备深Ⅱ°烧伤模型。第二部分烧伤创面内ILK基因转染及对创面愈合率的影响 目的探讨烧伤创面内ILK基因转染及对创面愈合率的影响。 方法采用ILK重组慢病毒载体，将三质粒系统共转染293T细胞包装慢病毒，用Western Blot法检测目的基因ILK质粒表达。正式试验采用SD大鼠75只，在其背部皮肤制备深Ⅱ°创面，并随机分成5组，每组15只，分别是：①对照组：每天注射生理盐水100μL；②LV-GFP组：一次性注射空质粒慢病毒100μL （2E+8TU/mL）；③LV-GFP-ILK组：一次性注射ILK过表达慢病毒液100μL（2E+8TU/mL）；④QLT0267组：每天注射浓度100μMQLT0267液100μL；⑤DMSO组：每天注射含0.3%DMSO液100μL。实验持续21d，各组大鼠单独饲养，自由采食和饮水。测量各组大鼠创面愈合时间和愈合率。LV-GFP-ILK组用慢病毒液注射大鼠创面周围皮下，于注射后第14d取材，每组5只大鼠，标本行冰冻切片，倒置荧光显微镜下观察GFP表达情况；于注射后第7d、10d、14d、21d取材，Western Blot法检测转染后ILK蛋白表达，所得数据进行统计分析处理。 结果LV-GFP-ILK组大鼠创面皮肤样品的冰冻切片在荧光显微镜可见GFP表达，且ILK蛋白表达水平高LV-GFP组。第14d时，LV-GFP-ILK组创面愈合率为96.89%，QLT0267组创面愈合率56.32%，在各个时相均显著低于其他3组（P0.05），对照组、LV-GFP组和DMSO组三组之间创面愈合率无统计学意义（P0.05）。 结论皮下注射ILK重组慢病毒能成功感染大鼠创面周围的正常组织，并能显著上调ILK蛋白水平，且这一效应相对持久、稳定。上调ILK表达创面愈合率增高，抑制ILK活性则创面愈合率降低，，说明ILK具有促进创面愈合作用。 第三部分ILK在创面愈合过程中的作用以及与Fn、I型胶原、α-SMA和AKT磷酸化的关系 目的通过上调ILK表达或抑制ILK活性，检测Fn、I型胶原、α-SMA等影响创面愈合过程的重要蛋白表达，探讨ILK在创面愈合过程的作用及其可能机制。 方法动物试验分组及处理同第二部分。在试验第14d，各组随机选择5只大鼠，应用免疫组化SP法和Western Blot法分别检测ILK、AKT、PAKT在各组大鼠创面中的表达；对创面肉芽组织进行组织学染色，观察创面及周围组织结构的改变；PCR检测大鼠皮肤组织Fn、I型胶原、 ILK、α-SMA的基因表达。 结果SP法和Western Blot法检测：5组AKT蛋白表达差异无统计学意义（P0.05），LV-GFP-ILK组ILK蛋白表达增高（P0.05）， PAKT蛋白表达也明显增高（P0.05），创面新生表皮更厚、胶原沉积率更多； QLT0267组PAKT蛋白表达较其他组明显降低（P0.05）。PCR检测显示ILK mRNA表达增强后Fn mRNA、I型胶原mRNA、α-SMAmRNA表达增强。 结论烧伤创面组织中ILK水平提高能显著上调Fn、I型胶原、α-SMA基因的表达；ILK活性与PAKT蛋白表达量呈正相关。因此，ILK可能通过PI3K-AKT-PAKT途径，促进创面的愈合。
【关键词】：整合素连接激酶 创面愈合 慢病毒载体 QLT0267
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R644
【目录】：

• 中文摘要3-6
• ABSTRACT6-10
• 目录10-11
• 前言11-14
• 第一部分 烧伤创面动物模型的制备14-19
• 材料与方法14-16
• 结果16-17
• 讨论17
• 结论17-19
• 第二部分 烧伤创面内 ILK 基因转染及对创面愈合率的影响19-31
• 材料与方法19-23
• 结果23-24
• 讨论24-25
• 结论25-31
• 第三部分 ILK 在创面愈合过程中的作用以及与 Fn、I 型胶原、α-SMA和 AKT 磷酸化的关系31-53
• 材料与方法31-37
• 结果37-39
• 讨论39-41
• 结论41-53
• 参考文献53-59
• 中英文缩略词对照表59-60
• 攻读期间取得成果60-61
• 致谢61

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本文编号：627477