血管内皮细胞抗发形霞水母触手提取物缩血管反应的作用及机制研究

发布时间：2017-08-10 03:23

  本文关键词：血管内皮细胞抗发形霞水母触手提取物缩血管反应的作用及机制研究

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【摘要】：目的： 探讨血管内皮细胞（vascular endothelial cells，VECs）在抗发形霞水母（Cyanea capillata）触手提取物（tentacle extract，TE）缩血管反应中的保护作用，为防治C.capillata蜇伤提供新思路和新靶点。 方法： 1、验证TE对人奇静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVEC）的毒性作用： 1.1MTT法测细胞存活率：收集我国沿海C. capillata并经鉴定后提取C.capillata TE样品。①以浓度梯度为控制因素，加入不同浓度（0μg/ml、0.625μg/ml、1.25μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml、160μg/ml、320μg/ml）TE孵育细胞密度为4×105个/ml的HUVEC细胞6h，MTT法检测经HUVEC细胞的存活率。②另一方面以不同浓度（1μg/ml，2.5μg/ml，5μg/ml，10μg/ml）TE不同时间（6h，12h，24h，48h）孵育细胞密度为4×105个/ml的HUVEC细胞，MTT法检测HUVEC细胞的存活率。 1.2流式细胞术测TE作用后HUVEC细胞凋亡坏死：加入不同浓度（0μg/ml、1μg/ml，2.5μg/ml，5μg/ml，10μg/ml）TE处理HUVEC细胞6h后，采用流式细胞分析检测HUVEC细胞的凋亡。 2、血管舒缩因子前列环素（Prostacyclin，PGI2）、血栓素（Thromboxane，TXA2）、血管紧张素（Angiotensin Ⅱ，AngⅡ）含量检测： 2.1加入不同浓度TE（0μg/ml，1μg/ml，，2.5μg/ml，5μg/ml）作用HUVEC细胞6h，采用ELISA检测不同浓度TE作用HUVEC细胞后分泌PGI2、TXA2、AngⅡ的含量。 2.2浓度为5μg/ml TE加入HUVEC细胞后，分别作用0min、5min、30min、2h、6h、12h后，采用ELISA检测TE不同孵育时间HUVEC细胞分泌PGI2、TXA2、AngⅡ的含量。 3、观察SD大鼠股动脉血压（Blood pressure，BP）变化： SD大鼠（280～320g）麻醉后，行股主动脉插管及颈静脉插管法，分别予①对照组（0.9%生理盐水组）；②1.4mg/ml TE组；③10μmol/L环氧合酶抑制剂（吲哚美辛）+1.4mg/ml TE组；④10μmol/L血管紧张素转换酶抑制剂（卡托普利）+1.4mg/ml TE组药物干预。观察1h内股动脉BP的变化情况，以明确药物干预效果及VECs在TE缩血管毒性过程中的保护作用，并为临床治疗水母蜇伤筛选出有效的治疗药物。 4、SD大鼠心脏、肾脏功能的影响： 在整体动物检测BP变化情况实验结束后，迅速从股动脉插管处抽取实验动物动脉血，检测心肌酶、肾功能（LDH、CK、sCr及BUN）。结果： 1、TE对HUVEC细胞存活率的影响： ①当TE浓度小于2.5μg/ml时，HUVEC细胞存活率为100%，细胞活性与正常对照组（TE浓度0μg/ml）相比无明显统计学意义（P＞0.05）；当TE浓度大于5μg/ml时，HUVEC细胞开始出现死亡，TE浓度为5μg/ml时细胞存活率为97.55%，TE浓度为10μg/ml时细胞存活率为50%，当TE浓度为320μg/ml时HUVEC细胞已几乎全部死亡，细胞存活率仅为4.83%，以上结果均有统计学意义。因此在浓度为5～320μg/ml范围内时TE对HUVEC细胞的毒性作用具有浓度依赖性，随着TE浓度的增加其对HUVEC细胞毒性增强。 ②同一浓度TE随着预孵时间的延长，对HUVEC细胞产生的毒性作用不断增强，TE的毒性作用具有时间依赖性(P0.05)；当TE浓度为1μg/ml时，分别预孵HUVEC细胞6h和12h可见细胞存活率大于100%，由此可知TE在低浓度（≤1μg/ml）短时间（≤12h）内对HUVEC细胞具有促生长的作用，当TE浓度为2.5μg/ml时，预孵6h时细胞存活率100%，TE浓度为5μg/ml时，预孵6h时细胞开始出现死亡，TE浓度10μg/ml时HUVEC细胞大量死亡，细胞存活率小于50%(P0.05)。 由以上实验可知，浓度为5μg/ml的C.capillata TE预孵HUVEC细胞6h可引起细胞死亡,因此选择浓度为5μg/ml的TE做后续的实验；10μg/mlTE预孵6h可引起细胞明显死亡。 2、TE致HUVEC细胞凋亡与坏死： TE浓度在1～10μg/ml浓度时，导致的细胞坏死不明显（P＞0.05），在1μg/ml和2.5μg/ml浓度时TE导致的细胞凋亡尚不明显（P＞0.05），当TE浓度5μg/ml时可有部分细胞凋亡，当TE浓度10μg/ml时可有大量细胞凋亡（P＜0.05）。 3、血管舒缩因子PGI2、TXA2、AngⅡ含量检测： ①PGI2随TE作用浓度增加分泌量逐渐增大，TXA2随TE作用浓度增加分泌量无明显变化，PGI2/TXA2随TE作用浓度增大比值增大，AngⅡ随TE浓度增大分泌量增大，以上结果均有统计学意义。故HUVEC细胞分泌的PGI2、AngⅡ及PGI2/TXA2比值在TE作用下可发生变化，且具有剂量依赖性，随TE浓度增大而增大。 ②TE（5μg/ml）预孵HUVEC细胞一定时间内（0min～12h）可引起HUVEC细胞舒缩因子PGI2、TXA2、AngⅡ分泌量改变，PGI2随着TE刺激时间的延长分泌量逐渐增加，5min时分泌量达高峰，6h分泌量开始下降，但分泌量仍高于正常水平，12h与6h分泌量无明显差别；TXA2随着TE刺激时间的增加分泌量逐渐增高，在6h到达高峰，12h与6h分泌量无明显差别； AngⅡ在5min分泌量仍高于正常水平，在2h达最高值，6h分泌量又下降，但分泌量仍高于正常水平，分泌量6h与12h分泌量无明显差别，以上结果均具有统计学意义。 4、SD大鼠股动脉BP变化 在观察时间（60min）内，与对照组（0.9%生理盐水组）相比，1.4mg/ml TE组SD大鼠股动脉BP在前10min内明显下降，10min时达最低值，后逐渐升高，60min时恢复至起始BP水平，整个观察时间内BP平均值均低于对照组；10μmol/L环氧合酶抑制剂（吲哚美辛）+1.4mg/ml TE组在观察时间内BP值较对照组无明显变化；10μmol/L血管紧张素转换酶抑制剂（卡托普利）+1.4mg/mlTE组在前10min内BP先下降后升高，在20～30min内恢复至对照组水平，后BP继续升高，且高于对照组，以上结果均具有统计学意义。 5、SD大鼠心、肾功能检测： 在整体动物股动脉BP监测实验结束后，从股动脉抽取实验动物动脉血，低温超速离心后取上清，行血生化检测结果显示与对照组（0.9%生理盐水组）相比，1.4mg/ml TE组SD大鼠心肌酶谱（LDH、CK）明显升高，肾功能（sCr、BUN）严重损害；10μmol/L环氧合酶抑制剂（吲哚美辛）+1.4mg/ml TE组、10μmol/L血管紧张素转换酶抑制剂（卡托普利）+1.4mg/ml TE组心肌酶（LDH、CK）升高较1.4mg/ml TE组低，肾功能（sCr、BUN）损害较较1.4mg/ml TE组轻，以上结果均具有统计学意义。 结论： 1.证明了TE对HUVEC细胞有直接的毒性作用，一定浓度TE及预孵时间可导致HUVEC细胞坏死与凋亡，降低细胞存活率。 2.TE作用HUVEC细胞，HUVEC细胞分泌PGI2、TXA2、AngⅡ含量可发生变化，HUVEC细胞通过对舒缩因子分泌量的调节，以此来拮抗TE引起的血管收缩反应。 3. TE可降低动物平均动脉BP及造成严重心肾功能损害，环氧合酶抑制剂（吲哚美辛）、血管紧张素转换酶抑制剂可调节VECs分泌舒缩因子PGI2、TXA2、AngⅡ的含量而拮抗TE特异的缩血管反应及降BP效应，并且减轻了心肾功能损伤。
【关键词】：血管内皮细胞 发形霞水母毒素 血管收缩 血管舒缩因子 吲哚美辛 卡托普利
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R646
【目录】：

• 摘要3-7
• ABSTRACT7-14
• 英文缩写及全文和中文对照表14-15
• 第1章 引言15-18
• 技术路线18-19
• 第2章 材料与仪器19-23
• 2.1 实验动物19
• 2.2 实验细胞19
• 2.3 实验试剂19-20
• 2.3.1 主要购置试剂19-20
• 2.3.2 主要配置试剂20
• 2.4 实验仪器20-21
• 2.5 动静脉导管制备21-23
• 第3章 方法23-28
• 3.1 实验思路23
• 3.2 C. capillata 采集与 TE 获取23
• 3.3 HUVEC 细胞培养23-24
• 3.4 检测 TE 对 HUVEC 的毒性作用24-25
• 3.4.1 MTT 检测 HUVEC 细胞存活率24
• 3.4.2 流式细胞技术检测 HUVEC 细胞凋亡24-25
• 3.5 ELISA 法检测血管舒缩因子 PGI2、TXA2、AngⅡ分泌量25-26
• 3.6 SD 大鼠动脉 BP 监测观察 VEC 的生物学效应及拮抗药物的干预效果26-27
• 3.7 心肌酶（LDH、CK）、肾功能（sCr、BUN）检测27
• 3.8 统计学处理27-28
• 第4章 实验结果28-39
• 4.1 MTT 法检测细胞存活率28-30
• 4.1.1 不同浓度 TE 作用对 HUVEC 细胞存活率的影响28-29
• 4.1.2 不同浓度、不同时间 TE 作用对 HUVEC 细胞存活率的影响29-30
• 4.2 Annexin V-PI 双染检测细胞凋亡30-32
• 4.3 ELISA 法检测血管舒缩因子 PGI2、TXA2、AngⅡ分泌量32-35
• 4.3.1 检测不同浓度 TE 作用 HUVEC 细胞后 PGI2、TXA2、AngⅡ分泌量32-34
• 4.3.2 检测同一浓度 TE 不同作用时间 HUVEC 细胞 PGI2、TXA2、AngⅡ分泌量34-35
• 4.4 SD 大鼠动脉 BP 监测观察 VEC 的体内效应及拮抗药物的干预效果35-37
• 4.5 SD 大鼠心、肾功能生化指标检测37-39
• 第5章 讨论39-44
• 5.1 血管内皮细胞在发形霞水母毒素毒性反应中的屏障保护作用39-40
• 5.2 血管内皮细胞在水母毒素反应中对血管舒缩因子分泌量的调节40-42
• 5.3 VECs 抗 TE 缩血管毒性反应的效应及初步药物筛选42-44
• 第6章 结论与展望44-45
• 6.1 结论44
• 6.2 展望44-45
• 致谢45-46
• 参考文献46-49
• 攻读学位期间的研究成果49-50
• 综述50-56
• 摘要50-55
• 参考文献55-56

【参考文献】

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1 周颖;陈虹;;血管内皮细胞功能紊乱与心血管疾病关系的研究进展[J];现代生物医学进展;2006年08期

本文编号：648626