人补体受体1型衍生分子融合蛋白CR1-SCR2D的构建及对小鼠脓毒症炎症损伤的保护作用

发布时间：2017-08-14 07:28

  本文关键词：人补体受体1型衍生分子融合蛋白CR1-SCR2D的构建及对小鼠脓毒症炎症损伤的保护作用

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【摘要】：脓毒症(sepsis)是由感染引起的全身炎症反应综合征(systemic inflammatoryresponse syndrome, SIRS)，是住院危重患者的主要死亡原因之一。脓毒症的发病机制比较复杂，涉及到各个系统的共同作用。其始动环节之一，是补体系统识别病原微生物发生过度活化。病原菌的菌体成分、内毒素、外毒素等使得补体系统过度激活，产生大量的炎症效应片段，造成后续级联放大的炎症反应。目前抑制补体的过度活化已成为防治脓毒症炎症损伤的重要策略之一。 在经典、旁路、凝集素三条通路中，补体激活的起始位点不同，但都形成C3转化酶，在C3处汇合，进而形成C5转化酶，共同进入终末途径。如果能在C3处防止C3/C5转化酶的形成，可减少炎症效应片段如C3a、C5a、C5b-9等的释放，在一定程度上就能够防止或减轻SIRS的发生与发展。 我室曾研制了人补体受体1型(complement receptor type1，CR1)的两个活性片段短同源重复序列(short consensus repeats，SCR)1-3和SCR15-17，分别用毕赤酵母进行表达，证明其具有体外抑制补体的生物活性作用和体内抗炎保护作用。这两个片段分别结合C4b和C3b，只能抑制一条或两条补体激活通路，保护作用有限。因此，本研究构建了能结合C4b、C3b的双功能域CR1衍生分子(complement receptor type1-shortconsensus repeats of two domains, CR1-SCR2D)，检测融合蛋白在体外抑制补体的生物活性，并进行了小鼠脓毒症损伤的保护性研究。本研究主要获得了以下实验结果： 1．表达质粒pPICZαB-SCR2D的构建。将毕赤酵母质粒pPIC9k原有的多克隆位点替换为新的多克隆位点pPIC9k(+)；用我室前期构建的pPIC9k-SCR1-3和pPIC9k-SCR15-17作模板，PCR扩增基因SCR1-3和SCR15-17，依次克隆连接到pPIC9k(+)上，在二者中间加入linker序列，构建含有目的基因的重组质粒pPIC9k(+)-SCR2D；最后将目的基因SCR2D克隆到载体pPICZαB上，得到表达载体pPICZαB-SCR2D。双酶切和测序鉴定表明，表达质粒pPICZαB-SCR2D构建成功。 2．表达质粒pPICZαB-SCR2D电转化毕赤酵母后进行表达及鉴定。表达质粒pPICZαB-SCR2D经过Sac I单酶切后电转毕赤酵母X-33感受态，从博来霉素(Zeocin)的YPD平板上挑取单克隆，行PCR鉴定阳性重组子。确立目的蛋白在重组酵母X-33/CR1-SCR2D中有分泌表达。采用小鼠抗人CR1抗体经Western blot鉴定，在分子量约90kDa处出现阳性条带。 3．目的蛋白CR1-SCR2D经Ni-NTA柱纯化及糖基化鉴定。表达上清过Ni-NTA柱后，低浓度咪唑洗脱杂蛋白，高浓度咪唑洗脱目的蛋白。SDS-PAGE电泳显示，，在分子量约90kDa处有弥散条带，目的蛋白纯度较高。目的蛋白经29kDa的Endo H糖苷酶处理后，分子量达到理论大小的45kDa，带型也变规则，证明CR1-SCR2D存在糖基化。 4．目的蛋白CR1-SCR2D的体外抑制补体生物活性鉴定。用CH50和AH50对目的蛋白CR1-SCR2D进行经典途径和旁路途径抑制补体活性检测，结果显示CR1-SCR2D均可抑制两条通路的激活，并且抑制补体活性分别高于SCR1-3和SCR15-17。去糖基化后的CR1-SCR2D对CH50和AH50溶血活性没有影响。另外证明CR1-SCR2D对旁路和MBL途径激活片段C4b、C3b在酵母多糖上沉积有抑制作用。 5．目的蛋白CR1-SCR2D对脓毒症小鼠炎症损伤的保护性效应。用盲肠结扎穿刺术(CLP)成功构建小鼠的脓毒症模型。进行分组实验，结果表明CR1-SCR2D在一定程度上能保护小鼠96h的生存率。CR1-SCR2D可以降低脓毒症小鼠24h后血清C5a、IL-6和TNF-α的水平，降低脓毒症小鼠肺脏的MPO水平，降低脓毒症小鼠血液的细菌水平。免疫组化结果表明，CR1-SCR2D使脓毒症小鼠C4b、C3b在肺脏上的沉积减少。小鼠肺脏病理学检查结果显示，CR1-SCR2D明显减轻了肺泡间隔和肺泡腔内出血、水肿、炎细胞浸润、局部实变的病理损伤。 综上所述，本实验成功构建毕赤酵母表达质粒pPICZαB-SCR2D，实现了目的蛋白CR1-SCR2D在毕赤酵母中的分泌表达，经过纯化获得了目的蛋白。体外生物活性结果证明，目的蛋白CR1-SCR2D可以抑制补体三条通路的激活。在小鼠体内，补体在脓毒症炎症损伤中起了重要作用，CR1-SCR2D通过抑制补体的过度激活达到了对脓毒症小鼠炎症损伤的保护效应。研究结果为脓毒症治疗的深入研究提供了新的思路和途径。
【关键词】：补体受体1型 融合蛋白 毕赤酵母 补体抑制活性 脓毒症 盲肠结扎穿刺术 保护作用
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R459.7
【目录】：

• 缩略语表5-8
• 氨基酸缩写表8-9
• Abstract9-12
• 摘要12-14
• 第一章 前言14-23
• 1.1 选题缘由14-15
• 1.2 研究背景15-21
• 1.3 研究意义21
• 1.4 研究内容21
• 1.5 研究方法21-23
• 第二章 人补体受体 1 型衍生分子融合基因 CR1-SCR2D 的构建、表达及生物学活性鉴定23-68
• 2.1 实验材料23-34
• 2.2 实验方法34-52
• 2.3 结果52-62
• 2.4 讨论62-68
• 第三章 补体在脓毒症小鼠炎症损伤中的作用及 CR1-SCR2D 的保护作用68-89
• 3.1 实验材料68-71
• 3.2 实验方法71-78
• 3.3 结果78-85
• 3.4 讨论85-89
• 全文总结89-90
• 参考文献90-97
• 文献综述97-114
• 参考文献107-114
• 攻读学位期间的研究成果114-115
• 致谢115

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