蛋白激酶C抑制剂诱导表皮细胞去分化及microRNAs差异表达的研究

发布时间：2017-08-15 05:21

  本文关键词：蛋白激酶C抑制剂诱导表皮细胞去分化及microRNAs差异表达的研究

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【摘要】：目的探讨蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)抑制剂GF109203X诱导表皮细胞去分化形成表皮样干细胞的可能性及诱导前后微小RNA(micro-RNA,miRNA)的差异表达分析。方法(1)采用酶消化法分离培养人原代表皮细胞。(2)将获得的细胞随机分为2组,实验组:原代表皮细胞培养2d后加GF109203X,终浓度为10μM;对照组:同期分离的原代表皮细胞培养2d后加等体积二甲基亚砜(DMSO)。诱导2d后采用免疫细胞化学染色法对2组细胞行β1整合素、角蛋白19(cytokeratin19,CK19)、CK14、CK10单克隆抗体检测鉴定。(3)TRIzol法提取2组细胞总RNA并用RNeasy Mini Kit纯化,使用NanoDrop ND-1000测量纯化后的RNA浓度,变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性,miRCURYTM Array Power Labeling kit标记样品并与miRCURYTM LNA Array(v.18.0)杂交芯片,Wash buffer kit清洗芯片后使用Axon GenePix 4000B扫描,GenePix pro 6.0读取探针信号值,对采集数据进行标准化及差异表达分析,实时定量RT-PCR验证微阵列芯片检测结果的可靠性。(4)对部分差异表达miRNAs靶基因行功能富集分析。结果(1)实验组细胞群诱导培养2d后形成明显克隆,免疫细胞化学染色显示β1整合素、CK19及CK14呈阳性表达,CK10阴性表达;对照组细胞群培养2d无明显克隆形成,β1整合素、CK19及CK14呈阴性表达,CK10呈阳性表达。(2)筛选出实验组细胞中表达上调的miRNAs 45个,表达下调的miRNAs34个。其中显著上调的mi RNA有hsa-miR-1-3p,hsa-miR-374a-5p,hsa-miR-144-5p等;显著下调的miRNA有hsa-miR-31-5p,hsa-let-7c-3p,hsa-miR-514a-3p等。(3)实时定量RT-PCR对表达上调最显著的hsa-miR-1-3p及表达下调最显著的hsa-miR-31-5p进行验证,与芯片检测结果具有较好的一致性。(4)miRNAs靶基因功能富集分析提示差异表达miRNAs参与细胞增殖与分化、细胞周期进展、凋亡等生物学过程。结论蛋白激酶C抑制剂GF109203X可诱导体外培养人表皮细胞去分化形成表皮样干细胞,并引起表皮细胞miRNA的差异表达。
【关键词】：去分化 表皮细胞 蛋白激酶C抑制剂GF109203X microRNA 表达谱
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R641
【目录】：

• 摘要3-4
• ABSTRACT4-8
• 中英文缩略词表8-9
• 第1章 前言9-11
• 第2章 材料与方法11-20
• 2.1 材料11-12
• 2.1.1 标本来源11
• 2.1.2 主要仪器11
• 2.1.3 主要试剂11-12
• 2.2 方法12-20
• 2.2.1 PKC抑制剂GF109203X的配制12
• 2.2.2 Ⅳ型胶原包被培养皿及盖玻片的制备12-13
• 2.2.3 表皮细胞的分离、培养与诱导13-14
• 2.2.4 免疫细胞化学染色分析14
• 2.2.5 提取两组细胞中的总RNA14-15
• 2.2.6 RNasey Mini Kit对总RNA的分离纯化15
• 2.2.7 纯化后RNA的质量检查15-16
• 2.2.8 miRNA的荧光标记、芯片杂交、清洗及扫描16-17
• 2.2.9 芯片数据处理17-18
• 2.2.10实时定量RT-PCR验证芯片结果18-19
• 2.2.11显著差异表达的miRNAs靶基因功能富集分析19-20
• 第3章 结果20-37
• 3.1 GF109203X对表皮细胞表型变化的影响20
• 3.2 免疫细胞化学染色结果分析20-22
• 3.3 总RNA提取结果22-23
• 3.4 芯片扫描结果23
• 3.5 散点图及相关系数表23-24
• 3.6 筛查结果24-27
• 3.7 聚类图27-28
• 3.8 Real Time RT-PCR验证分析结果28-31
• 3.9 差异表达miRNAs靶基因功能富集分析31-37
• 3.9.1 GO生物学功能分析结果31-33
• 3.9.2 GO分子功能分析结果33-34
• 3.9.3 GO在细胞成分分析结果34-35
• 3.9.4 差异表达miRNAs靶基因KEGG Pathway分析结果35-37
• 第4章 讨论37-41
• 第5章 结论41-42
• 致谢42-43
• 参考文献43-46
• 攻读学位期间研究成果46-47
• 综述47-52
• 参考文献51-52

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前7条

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本文编号：676445