脂肪间充质干细胞抑制烧伤创面内残存角质形成细胞凋亡的实验研究

发布时间：2017-08-25 18:03

  本文关键词：脂肪间充质干细胞抑制烧伤创面内残存角质形成细胞凋亡的实验研究

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【摘要】：研究意义 随着社会的进步和医学水平的不断提高，加之人们美学标准的相应提高，在救治烧（烫）伤患者生命的同时，对烧伤创面的治疗与处理的标准也不断提高。因此，在烧伤早期对烧伤创面及时正确的处理显得尤为重要。创面的修复主要是由创面内或局部的角质形成细胞（Keratinocytes，KCs）、成纤维细胞及相应的细胞或组织因子之间的相互作用来完成的，其最终结局为损伤部位的再上皮化。在这一过程中角质形成细胞（KCs）的作用显得尤为重要，创面内或局部缺乏角质形成细胞（KCs）或者角质形成细胞（KCs）活性不佳往往会造成创面延迟愈合甚至无法愈合。烧伤往往会造成创面中角质形成细胞（KCs）凋亡、坏死，而在烧伤早期创面中残存少量的KCs和其他细胞，而这些细胞的转归在一定程度上决定了烧伤创面的预后。 间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）为一种来源于组织间质的成体干细胞，MSCs不仅具有干细胞相关的自我更新、多向分化转分化的潜能，而且还具有较强的旁分泌及免疫调节功能，同时其在促进创面修复和改善组织损伤方面作用明显。脂肪间充质干细胞（Adipose-derived stem cells, ADSCs）为一类来源于脂肪间质的MSCs，其具有MSCs的相关特性。因此本研究拟在烧伤早期通过利用ADSCs的相关特性对烧创面进行干预，检测其对热损伤引起的KCs凋亡的影响，并初步探讨ADSCs可能相关的作用机制，，进而为日后采用ADSCs进行创面治疗提供一定的理论依据。 研究方法 1.取健康雌性BALB/c小鼠5只，采用胶原酶消化法分离纯化脂肪间充质干细胞（ADSCs）。取第3代细胞进行形态学观察，采用流式细胞仪检测间充质干细胞表面相关标记物CD31、CD34、CD45、CD90、CD105；并行成脂、成骨诱导分化鉴定。 2.取雌性新生3d BALB/c子鼠3只，采用胰蛋白酶消化法分离培养角质形成细胞（KCs）；常规复苏人角质形成细胞系（HaCaT细胞）；利用51.5℃的恒温水浴中孵育上述细胞35s建立KCs的热损伤模型；吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)染色后检测KCs热损伤模型的凋亡情况；流式细胞仪检测热损伤后即刻凋亡率。 3. HaCaT细胞以0.9%NaCl饥饿孵育24h后随机分为对照组和实验组，分别以无血清DMEM和体积分数100%ADSCs-CM分别培养12h后，采用AO/EB法检测2组细胞的凋亡情况；HaCaT细胞热损伤后按随机数表法分为常规培养组、无血清培养组、50%ADSCs-CM组、100%ADSCs-CM组，分别以含体积分数10%FBS的DMEM培养液、无血清DMEM培养液、含体积分数50%ADSCs-CM的DMEM培养液（无血清DMEM: ADSCs-CM=1:1）、体积分数100%ADSCs-CM常规培养；于处理后3h、6h、12h、24h采用AO/EB染色法检测各组细胞的凋亡情况；处理12h后，流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率和细胞周期分布；Real-time PCR和Western-blot检测Bcl-2、Caspase-3的mRNA和蛋白的表达水平。 4.健康雌性BALB/c小鼠20只，背部脱毛后随机分为假烫组和烫伤组，烫伤组采用93±2℃蒸汽烫伤5s，假烫组采用37℃水浴处理5s；于处理后0h、3h、6h、12h、24h及48h切取背部皮肤组织，病理切片后，镜下观察组织病理变化；于伤后0h、3h、6h、12h、24h切取背部皮肤组织，病理切片后TUNEL染色法检测创面内KCs凋亡情况。 5.健康雌性BALB/c小鼠18只，背部脱毛后随机分为对照组、DMEM组和ADSCs-CM组，采用93±2℃蒸汽烫伤5s，于伤后0h、2h、4h、分别以等量的无菌PBS、无血清DMEM培养液、体积分数100%ADSCs-CM进行表面湿敷和创面周围相同部位进行局部注射；于伤后6h切取背部皮肤，病理切片后TUNEL染色法检测创面内细胞凋亡情况；免疫组织化学法检测组织内Bcl-2、Caspase-3的表达水平；Real-time PCR和Western-blot检测Bcl-2、Caspase-3的mRNA和蛋白的表达水平。 研究结果 1.采用胶原酶消化法分离培养的细胞形态规则，与成纤维细胞类似，所培养的细胞在第3代时CD3l-、CD34-、CD45-、CD90+、CDl05+表达率均大于90%，符合ADSCs的免疫学表型；经成脂、成骨诱导培养，其可向脂肪细胞和骨细胞分化，证实培养的细胞为ADSCs。 2.原代培养的小鼠KCs形态较好，呈铺路石状样，与典型的角质形成细胞一致，传至第3~5代后细胞易老化；HaCaT细胞复苏后形态良好，细胞轮廓清晰呈典型的铺路石状，细胞状态佳且稳定，形态典型。利用51.5℃水浴孵育小鼠KCs和HaCaT细胞35s后，第3代小鼠KCs热损伤后死亡较多，其即刻凋亡率波动较大，不具有稳定性，无统计学意义（P＞0.05）。热损伤后HaCaT细胞部分死亡脱落，残存的细胞胞体皱缩，细胞周围出现高透亮光圈，即刻凋亡率为（9.8±0.45）%，差异具有统计学意义（P＜0.05）。 3. ADSCs-CM可明显的抑制饥饿引起的HaCaT细胞凋亡。HaCaT细胞于热损伤后12h达到凋亡的峰值。利用体积分数100%ADSCs-CM处理热损伤后HaCaT细胞，其可在mRNA和蛋白水平明显的上调Bcl-2的表达，下调Caspase-3的表达，进而降低HaCaT细胞的凋亡率。处理12h后，体积分数100%ADSCs-CM可明显的缓解热损伤引起的HaCaT细胞G2/M期阻滞。 4.利用93±2℃蒸汽作用于小鼠背部皮肤5s，可建立稳定的深Ⅱ°烫伤模型。创面局部及残存毛囊内KCs于伤后6h达到凋亡的高峰。 5.在烫伤早期利用体积分数100%ADSCs-CM处理烫伤创面，其可在mRNA和蛋白水平明显的上调组织内Bcl-2的表达，下调组织内Caspase-3的表达，进而减少KCs的凋亡数量。 研究结论 体外细胞实验和小鼠在体实验证明ADSCs可以在一定程度上抑制热损伤引起的KCs的凋亡，而这种生物学效应是ADSCs通过其旁分泌功能来上调Bcl-2和下调Caspase-3的表达来实现的。本研究结果提示在热损伤引起的KCs凋亡中，ADSCs是通过旁分泌和调节Bcl-2和Caspase-3的表达的双重机制来抑制细胞凋亡的，在烧伤创面治疗早期具有一定的应用潜力。
【关键词】：间充质干细胞 烧伤 角质形成细胞 细胞凋亡
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R644
【目录】：

• 缩略语表4-6
• 中文摘要6-10
• Abstract10-14
• 前言14-16
• 文献回顾16-28
• 实验一 小鼠 ADSCS的分离培养与鉴定28-37
• 1 材料28-30
• 2 方法30-33
• 3 结果33-35
• 4 讨论35-37
• 实验二 小鼠 KCS的分离培养及热损伤模型的建立37-47
• 1 材料37-38
• 2 方法38-42
• 3 结果42-45
• 4 讨论45-47
• 实验三 小鼠 ADSCS对热损伤引起的 KCS凋亡的影响47-63
• 1 材料47-49
• 2 方法49-54
• 3 结果54-61
• 4 讨论61-63
• 实验四 小鼠深Ⅱ°烫伤模型的建立及创面内 KCS凋亡情况的检测63-72
• 1 材料63-64
• 2 方法64-67
• 3 结果67-71
• 4 讨论71-72
• 实验五 ADSCS对烧伤创面内残存 KCS凋亡的影响72-86
• 1 材料72-75
• 2 方法75-79
• 3 结果79-84
• 4 讨论84-86
• 小结86-88
• 参考文献88-97
• 个人简历和研究成果97-99
• 致谢99-100

【参考文献】

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1 Raquel Taléns-Visconti;Ana Bonora;Ramiro Jover;Vicente Mirabet;Francisco Carbonell;José Vicente Castell;María José Gómez-Lechón;;Hepatogenic differentiation of human mesenchymal stem cells from adipose tissue in comparison with bone marrow mesenchymal stem cells[J];World Journal of Gastroenterology;2006年36期

本文编号：737675