嗜铬粒蛋白A衍生多肽CHR抑制炎症所致血管内皮细胞高通透性的作用和初步机制探讨

发布时间：2017-09-06 12:33

  本文关键词：嗜铬粒蛋白A衍生多肽CHR抑制炎症所致血管内皮细胞高通透性的作用和初步机制探讨

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【摘要】：目的：观察嗜铬粒蛋白A衍生多肽CGA47-66（Chromfungin，CHR）对炎症介质引起的血管内皮细胞高通透性的影响，以及探讨其初步机制。 方法：分别用CHR、脓毒性休克患者血清、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）作用人脐静脉内皮细胞株EA.hy926。 （1）采用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法、Transwell小室法测定EA.hy926的活性〔吸光度（A）值〕和通透性（A值）。 （2）应用免疫荧光法、PCR和Western-blot分别观察细胞纤维肌动蛋白（F-actin）的形态和血管内皮钙粘蛋白VE-cadherin的表达及分布，检测血管内皮钙粘蛋白VE-cadherin mRNA表达，以及ROCK、磷酸化p38MAPK和总p38MAPK等同渗透性相关蛋白的表达。 结果：（1）观察CHR对EA.hy926的活性和通透性的影响。与空白对照组比较，1、10、100nmol/L CHR对EA.hy926细胞活性无明显影响，而1000nmol/L CHR对EA.hy926细胞活性有显著抑制作用（A值：1.049±0.256比1.306±0.162，t=-2.390, P=0.031）。与空白对照组比较，1、10、100nmol/L CHR组EA.hy926细胞的通透性明显降低（A值：1.619±0.324、1.496±0.356、1.132±0.280比2.315±0.440，均P＜0.05）；脓毒性休克患者血清组和TNF-α组EA.hy926细胞通透性明显升高（血清组A值：1.204±0.248比0.277±0.017，t=9.145, P=0.000；TNF-α组A值：2.485±0.113比1.602±0.679，t=2.868，P=0.043）；1、10、100nmol/LCHR可明显降低脓毒性休克患者血清和TNF-α引起的EA.hy926细胞高通透性（血清组A值：0.299±0.065、0.224±0.028、0.131±0.015比1.204±0.248，均P＜0.05；TNF-α组A值：1.995±0.394、1.920±0.096、1.744±0.475比2.485±0.113，均P＜0.05），且在1～100nmol/L范围内，CHR的上述作用呈现一定的剂量依赖性。 （2）检测CHR对渗透性相关分子的影响。应用PCR技术观察TNF-α组中VE-cadherin mRNA的表达较空白对照组的显著降低（1.15±0.03比1.59±0.16，P0.05），，而CHR（1nM、10nM、100nM）组中EA.hy926细胞的VE-cadherin mRNA的表达较空白对照组有显著增加（1.51±0.04、1.62±0.17、1.92±0.36比1.16±0.19，P0.05）。CHR（1nM、10nM、100nM、1000nM）能够缓解TNF-α引起的VE-cadherinmRNA的低表达（1.54±0.15、1.52±0.10、2.09±0.44、1.64±0.16比1.15±0.03，P0.05），上述作用在1～100nM范围内也呈现一定的剂量依赖性。免疫荧光技术观察到，与空白对照组比较，TNF-α组中F-actin细胞骨架发生明显重组和再分布，应力纤维形成增多，VE-cadherin的表达也明显减少，而CHR可以抑制上述变化。Western-blot检测到TNF-α组EA.hy926细胞的ROCK、磷酸化p38MAPK蛋白表达明显高于空白对照组，TNF-α+CHR组与TNF-α组相比，TNF-α+CHR组中ROCK、磷酸化p38MAPK蛋白表达明显降低；空白对照组和各实验组相比，总p38MAPK蛋白表达无明显差异。 结论：CGA衍生多肽CHR能改善炎症介质（脓毒性患者血清和TNF-α）引起的血管内皮细胞高通透性，这一作用在一定剂量范围内呈剂量依赖性，并且可能与RhoA/ROCK、p38MAPK信号通路相关。
【关键词】：嗜铬粒蛋白A 多肽 CHR 人脐静脉内皮细胞系EA.hy926 内皮细胞通透性 炎症介质 脓毒性休克 肿瘤坏死因子
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R459.7
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照6-8
• 摘要8-11
• ABSTRACT11-14
• 前言14-17
• 1 内皮细胞通透性在脓毒症发病机制中的核心作用14
• 2 炎症因子导致血管内皮细胞通透性改变的已知机制14-15
• 3 脓毒症中内皮细胞通透性改变的干预治疗仍是一个严峻问题15-16
• 4 肾上腺髓质激素CGA及其衍生多肽在脓毒症中的重要作用16
• 5 科学假设与研究的路线框架16-17
• 材料和方法17-25
• 1 材料17-20
• 2 实验方法20-25
• 2.1 细胞培养20
• 2.2 MTT比色法检测细胞活性20
• 2.3 Transwell小室法检测EA.hy926 细胞通透性20
• 2.4 PCR检测血管内皮钙粘蛋白VE-cadherin mRNA的表达20-22
• 2.5 细胞免疫荧光及激光共聚焦显微镜观察EA.hy926 细胞的细胞纤维肌动蛋白（F-actin）和血管内皮细胞钙粘蛋白（VE-cadherin）的表达和分布22-23
• 2.6 Western-blot检测EA.hy926 细胞ROCK、磷酸化p38MAPK和总p38MAPK蛋白的表达23-25
• 3 统计处理25
• 结果25-34
• 1 细胞形态25-26
• 2 CHR对EA.hy926 细胞活性的影响26-27
• 3 CHR对EA.hy926 细胞通透性的影响27-29
• 4 CHR对EA.hy926 细胞的VE-cadherin mRNA表达的影响29-31
• 5 CHR对EA.hy926 细胞的F-actin和VE-cadherin的表达及分布的影响31-33
• 6 CHR对EA.hy926 细胞的通透性相关蛋白表达的影响33-34
• 讨论34-38
• 结论38-39
• 参考文献39-43
• 文献综述43-53
• 参考文献50-53
• 致谢53-54
• 攻读硕士期间发表的论文及获奖情况54-55
• 附件55-56

【参考文献】

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1 唐雪;王瑞兰;;手持式正交偏振光谱和侧流暗视野成像技术在脓毒症微循环监测中的应用进展[J];中国全科医学;2011年18期

本文编号：803156