缺锌对异氟醚麻醉阿尔茨海默病模型小鼠学习记忆功能的影响及机制研究

发布时间：2017-10-30 04:40

  本文关键词：缺锌对异氟醚麻醉阿尔茨海默病模型小鼠学习记忆功能的影响及机制研究

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【摘要】：背景：阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）又称老年性痴呆，是一种常见的老年神经变性疾病，是人类痴呆的主要原因，目前尚无有效治疗措施。目前研究显示，65岁以上的老年人中AD的发病率约为12％，85岁以上的老年人AD的发病率约达50％，AD已成为当前老年医学所面临的最为严峻的问题之一。随着麻醉理念的不断更新以及麻醉技术的不断提高，老年患者全麻下手术在临床广泛应用，随之而来引人关注的问题是全麻对老年及合并AD等神经变性疾病病人的影响，，这是麻醉学领域近年来研究的热点课题之一。AD的病因还不十分清楚，可能是遗传和环境因素共同作用诱发的结果，而老龄是其重要诱发因素。近年来流行病学调查和大量的研究证实，全麻药物也是AD的诱发因素，能够增加AD发病的风险，加重AD神经病理改变。临床研究表明，全麻能够降低AD的发病年龄和增加AD的发病率，加重AD的症状和神经病理过程。与局麻比较，全麻能够明显增加心脏手术病人AD的发病风险。目前全世界每年有2.3亿人在接受麻醉和手术，其中接受麻醉的AD患者达800万以上，同时AD的发病具有隐匿性，在临床发病前可有长达15~30年的临床前期（临床症状不明显），临床上接受全身麻醉（手术治疗）的老年患者中可能有相当一部分处于AD临床前期，对于这些患者可能存在一个巨大的麻醉安全风险和隐患。因此，全麻药促进阿尔茨海默病发病的机制、其影响因素及如何防治的研究成为目前麻醉学领域亟待解决的临床重大课题之一。 锌是重要的生命元素，是维持大脑正常功能所必需的微量元素，与学习记忆等脑功能密切相关。在哺乳动物中枢神经系统，锌与多种金属蛋白酶活性区结合，调节这些酶的活性，还以神经递质或调质的形式调节脑功能，在学习记忆功能中起重要作用。全世界有25%的AD人群存在锌缺乏，其血锌水平降低。AD时血锌降低与认知功能损害密切相关。研究表明缺锌能够加重AD模型小鼠神经病理进程和认知功能障碍。研究发现锌稳态失衡（锌缺乏）能够引起神经元严重损害，导致包括AD等在内多种神经变性疾病的发生。吸入麻醉药异氟醚是临床常用的全麻药物。研究证实异氟醚麻醉具有潜在的AD神经毒性作用，长时间或重复暴露异氟醚能够促进AD神经病理进程和加剧AD病情的进展。动物研究发现，给予临床相关浓度的异氟醚麻醉能够诱导神经细胞凋亡，加速β淀粉样蛋白（beta-amyloid protein,Aβ）聚集，加剧AD神经病理进程，产生一个与AD病人相似的认知功能缺陷和脑损伤。但缺锌是否成为吸入麻醉药异氟醚促进AD发病的一个重要风险因素，缺锌能否加剧吸入麻醉药对AD神经毒性作用和学习记忆损害尚不清楚。 目的：（1）观察缺锌对异氟醚麻醉阿尔茨海默病模型小鼠学习记忆功能的影响，并对其潜在的机制进行研究。（2）探讨缺锌是否成为吸入麻醉药异氟醚促进AD发病的一个重要风险因素，为锌营养缺乏AD人群和认知功能障碍病人的临床麻醉用药以及麻醉方案的选择提供实验依据。 方法：随机将8月龄APP/PS1双转基因小鼠分为4组（n=20）：常锌对照组（Control组）、异氟醚+常锌组（Iso组）、缺锌组（Zinc组）、异氟醚+缺锌组（Iso+Zinc组）。常锌对照组，小鼠每天给予正常含锌饲料饮食（饲料中锌含量为30mg/kg），不做任何处理；Iso组，小鼠每天给予正常含锌饲料饮食（饲料中锌含量为30mg/kg），实验时小鼠给予1.4%异氟醚麻醉2h；Zinc组，小鼠实验前给予低锌饲料饮食喂养（饲料中锌含量为1mg/kg）1个月；Iso+Zinc组，小鼠实验前给予低锌饲料饮食喂养（饲料中锌含量为1mg/kg）1个月，然后小鼠给予1.4%异氟醚麻醉2h。实验前采用电感耦合等离子体质谱检测各组小鼠血锌含量，据以判断小鼠缺锌建模是否成功（模型建立不成功的小鼠剔除本研究）。部分小鼠麻醉后24h应用Morris水迷宫检测空间学习记忆能力。部分小鼠在麻醉后24h断头取海马组织，一部分海马制作脑组织切片，应用原位末端标记（TUNEL）染色观察小鼠海马神经元凋亡；另一部分海马制备脑组织匀浆，应用蛋白印迹法（Western Blot）检测Aβ聚集（Aβ、Aβ1-40、Aβ1-42）、Tau蛋白磷酸化（pTau）及Tau蛋白磷酸化位点（pSer396、pSer262、pThr231）的磷酸化水平、线粒体凋亡信号通路基因（Bcl-2、Bax、Caspase-3）和内质网应激凋亡信号通路基因（CHOP、Caspase-l2、Grp78）表达的变化。 结果：（1）缺锌AD小鼠模型的建立成功。Control组和Iso组小鼠麻醉前血锌均为正常水平；与Control组比较，Zinc组和Iso+Zinc组小鼠给予低锌饮食后血锌水平均明显降低，表明成功建立缺锌AD小鼠模型。（2）缺锌对异氟醚麻醉APP/PS1双转基因小鼠学习记忆功能的影响。与Control组比较，Iso组Morris水迷宫检测小鼠逃避潜伏期和空间探索时间差异无显著性，表明1.4%异氟醚麻醉2h不影响APP/PS1双转基因小鼠的学习记忆功能；与Control组比较，Zinc组小鼠逃避潜伏期延长，空间探索时间缩短，表明缺锌能够损害APP/PS1双转基因小鼠的学习记忆功能；与Iso组和Zinc组比较，Iso+Zinc组缺锌小鼠逃避潜伏期进一步延长，空间探索时间进一步缩短，表明缺锌明显加剧异氟醚麻醉APP/PS1双转基因小鼠学习记忆功能损害。（3）缺锌对异氟醚麻醉APP/PS1双转基因小鼠海马神经元凋亡的影响。与Control组比较，Iso组小鼠海马CA1区神经元凋亡率增加，表明1.4%异氟醚麻醉2h能够诱导转基因AD模型小鼠海马神经元凋亡；与Control组比较，Zinc组海马CA1区神经元凋亡率明显增加，表明缺锌能够诱导APP/PS1双转基因小鼠海马神经元凋亡；与Iso组和Zinc组比较，Iso+Zinc组缺锌小鼠海马CA1区神经元凋亡率进一步增加，表明缺锌明显加剧异氟醚诱导APP/PS1双转基因小鼠海马神经元凋亡。（4）缺锌对异氟醚麻醉APP/PS1双转基因小鼠海马Aβ聚集的影响。与Control组比较，Iso组小鼠海马组织总Aβ、Aβ1-40、Aβ1-42表达差异无显著性，表明1.4%异氟醚麻醉2h不影响APP/PS1双转基因小鼠海马Aβ的聚集；本研究还显示，与Control组比较，Zinc组海马组织总Aβ、Aβ1-40表达差异无显著性，Aβ1-42表达增加，表明缺锌能够诱导APP/PS1双转基因小鼠海马Aβ1-42聚集，加速AD小鼠海马Aβ病理改变；本研究还表明，与Iso组和Zinc组比较，Iso+Zinc组缺锌APP/PS1双转基因小鼠海马组织总Aβ、Aβ1-40表达无明显改变，Aβ1-42表达进一步增加（p0.05），提示缺锌明显加剧异氟醚麻醉APP/PS1双转基因小鼠海马Aβ病理进程，加速海马Aβ聚集。（5）缺锌对异氟醚麻醉APP/PS1双转基因小鼠海马Tau蛋白磷酸化的影响。与Control组比较，Iso组小鼠海马组织pTau、pSer396、pSer262、pThr231表达差异无显著性，表明1.4%异氟醚麻醉2h不影响APP/PS1双转基因小鼠海马Tau蛋白和Tau蛋白Ser396、Ser262、Thr231位点的磷酸化水平；本研究还显示，与Control组比较，Zinc组海马组织pSer396表达轻度增加，pTau、pSer262、pThr231表达明显增加，表明缺锌对Tau蛋白Ser396位点的磷酸化水平无明显影响，但能够增强APP/PS1双转基因小鼠海马Tau蛋白及Tau蛋白Ser262和Thr231位点的磷酸化，加重海马Tau蛋白病理改变；本研究还表明，与Zinc组比较，Iso+Zinc组缺锌小鼠给予1.4%异氟醚麻醉2h，海马组织Tau蛋白和Tau蛋白Ser396、Ser262、Thr231位点磷酸化水平均进一步增强，提示缺锌明显加剧异氟醚麻醉APP/PS1双转基因小鼠海马Tau蛋白和Tau蛋白Ser396、Ser262、Thr231位点过度磷酸化，加速其海马Tau蛋白病理进程。（6）缺锌对异氟醚麻醉APP/PS1双转基因小鼠海马线粒体相关凋亡信号通路的影响。与Control组比较，Iso组小鼠海马组织Bcl-2表达减少、Bax和Caspase-3表达增强，表明1.4%异氟醚麻醉2h能活化APP/PS1双转基因小鼠海马线粒体相关凋亡信号通路，诱导促凋亡基因Bax和Caspase-3的活化，抑制抗凋亡基因Bcl-2的表达；本研究还显示，与Control组比较，Zinc组海马组织Bcl-2表达减少、Bax和Caspase-3表达增强，表明缺锌能诱导APP/PS1双转基因小鼠海马线粒体相关凋亡信号通路基因Bax和Caspase-3的活化，抑制Bcl-2基因的表达；本研究还表明，与Iso组和Zinc组比较，Iso+Zinc组缺锌小鼠海马组织Bcl-2表达进一步减少、Bax和Caspase-3表达进一步增强，提示缺锌明显加剧异氟醚麻醉APP/PS1双转基因小鼠海马线粒体相关凋亡信号通路的活化，促进Bax和Caspase-3基因的活化，抑制Bcl-2基因的表达。（7）缺锌对异氟醚麻醉APP/PS1双转基因小鼠海马内质网应激相关凋亡信号通路的影响。与Control组比较，Iso组小鼠海马组织内质网应激相关凋亡信号通路基因CHOP、Caspase-l2、Grp78的表达差异无显著性，表明1.4%异氟醚麻醉2h对APP/PS1双转基因小鼠海马内质网应激的活化无影响；本研究还显示，与Control组比较，Zinc组海马组织CHOP、Caspase-l2、Grp78表达增强，表明缺锌能诱导APP/PS1双转基因小鼠海马组织内质网应激的活化，促进海马内质网应激相关凋亡信号通路基因CHOP、Caspase-12、Grp78的表达；本研究还表明，与Iso组和Zinc组比较，Iso+Zinc组缺锌APP/PS1双转基因小鼠海马组织CHOP、Caspase-l2、Grp78表达进一步增强，提示缺锌明显加剧异氟醚麻醉APP/PS1双转基因小鼠海马内质网应激的活化，促进内质网应激相关凋亡信号通路基因CHOP、Caspase-12、Grp78的表达。 结论：1.4%异氟醚麻醉2h不影响APP/PS1双转基因小鼠的学习记忆功能，但对APP/PS1双转基因小鼠产生潜在的神经毒性作用，能够活化线粒体相关的凋亡级联信号通路，诱导小鼠海马神经元凋亡；缺锌明显加剧异氟醚麻醉APP/PS1双转基因小鼠学习记忆功能损害和海马神经元凋亡，其机制与其促进海马Aβ聚集和Tau蛋白磷酸化，活化线粒体和内质网应激相关的凋亡级联信号通路有关。
【关键词】：阿尔茨海默病 锌 异氟醚 学习记忆 神经毒性 吸入麻醉药
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R749.16;R-332
【目录】：

• 前言4-6
• 中文摘要6-10
• Abstract10-18
• 中英文缩略词对照表18-19
• 第1章 绪论19-45
• 1.1 引言19-20
• 1.2 文献综述20-45
• 1.2.1 锌在中枢神经系统中的生理和病理作用20-36
• 1.2.2 全身麻醉和阿尔茨海默病36-45
• 第2章 实验材料和方法45-55
• 2.1 实验材料45-48
• 2.1.1 实验动物45
• 2.1.2 实验器械、装置及仪器45-46
• 2.1.3 主要试剂46-48
• 2.2 实验方法48-53
• 2.2.1 实验动物48
• 2.2.2 饲料配方48-49
• 2.2.3 实验动物分组及模型建立49
• 2.2.4 小鼠全身麻醉过程49-50
• 2.2.5 水迷宫实验（Morris Water Maze，MWM）50
• 2.2.6 标本制备50-52
• 2.2.7 TUNEL 染色52-53
• 2.3 实验分组及实验流程图53-54
• 2.4 统计学处理54-55
• 第3章 实验结果55-71
• 3.1 APP/PS1 双转基因小鼠基因鉴定55
• 3.2 缺锌 AD 小鼠模型的建立55-56
• 3.3 缺锌对异氟醚麻醉 APP/PS1 双转基因小鼠学习记忆功能的影响56-59
• 3.4 缺锌对异氟醚麻醉 APP/PS1 双转基因小鼠海马神经元凋亡的影响59-61
• 3.5 缺锌对异氟醚麻醉 APP/PS1 双转基因小鼠海马 Aβ聚集的影响61-63
• 3.6 缺锌对异氟醚麻醉 APP/PS1 双转基因小鼠海马 Tau 蛋白磷酸化的影响63-66
• 3.7 缺锌对异氟醚麻醉 APP/PS1 双转基因小鼠海马线粒体相关凋亡信号通路的影响66-67
• 3.8 缺锌对异氟醚麻醉 APP/PS1 双转基因小鼠海马内质网应激相关凋亡信号通路的影响67-71
• 第4章 讨论71-79
• 第5章 结论79-81
• 参考文献81-107
• 作者简介及在学习期间所取得的科研成果107-109
• 致谢109

【共引文献】

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本文编号：1116173