Rac1和Cdc42信号通路在可卡因诱导的神经元树突重塑中的调控作用

发布时间：2018-01-31 10:03

  本文关键词： 可卡因 树突重构 Rac1 Cdc42 CPu Hippocampus　出处：《南方医科大学》2013年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：毒品成瘾(drug addiction)是目前世界范围内重大的社会问题,全世界每年约10万人死于吸毒。同样地,毒品成瘾也已成为我国日益严重的社会问题,我国登记在册的吸毒人员有100万左右,而实际人数远高于此。开展毒品成瘾机制的研究,并进一步寻找有效的治疗成瘾的药物,具有深远的社会意义和巨大的市场前景。毒品成瘾是一种持久性的脑部疾病。可卡因的长时间暴露可导致神经元内的持久改变,包括细胞内信号通路的改变、神经元树突形态结构的改变和行为学的可塑性变化。在各种成瘾动物模型中发现,神经元的一种持久性适应性改变就是纹状体中多巴胺能中度棘神经元(MSNs)的树突分支增多、树突棘密度增加。这一神经适应性改变导致了可卡因成瘾诱导的突触疾结构和功能的改变。尽管已有大量文献报道了可卡因可诱导纹状体神经元树突棘增多,但其具体的分子机制的研究还不够清晰。树突的重构需要骨架蛋白的形态的改变。已有研究报道,树突棘形态受到骨架蛋白结构改变的调节,而骨架蛋白受到小G蛋白家族的调节。小G蛋白家族中最重要的是Rho家族蛋白种的Rac1、RhoA和Cdc42,这三种蛋白相互协调、相互依赖,共同调节骨架蛋白的结构重组和形成。RhoA和Rac1/Cdc42的作用相反,Rac1/Cdc42对神经元的发生、迁移、生长、维持等起到促进作用,而RhoA对神经元的形成和维持起到抑制作用。体内Rho有两种形式,即GDP结合的无活性状态与GTP结合的活性状态。并且,通过体内三类蛋白,即鸟苷酸转换因子(guanine nucleotide exchange factor,GEF)、GTPase 激活因子(GTPase activating protein,GAP)与鸟甘酸解离抑制子(guanine nucleotide dissociation inhibitor,GDI),有序地调控Rho蛋白活性状态的转换。多巴胺受体包括D1类(D1和D5亚类)和D2类(D2、D3和D4亚类)两大类,它们在可卡因诱导的纹状体伏核(NAc)区神经生物学改变中起到了重要的作用。已有研究证实,细胞内信号级联与多种多巴胺受体相互作用,介导了脑内药物成瘾诱导神经适应性改变。中度棘神经元(MSNs)占NAc区神经元总量的90%以上,它可以分为两大类:一类是表达D1受体的直接通路的MSNs,另一类是表达D2受体的间接通路的MSNs。在纹状体中,大约50%的MSNs只表达D1受体,35-40%的MSNs只表达D2受体,还有10-15%的MSNs同时表达D1和D2受体。课题组前期探讨了 D1和D3多巴胺受体(dopamine receptor)可通过 NMDA(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受体、ERK(extracellular signal-regulated kinase,ERK)信号通路相反的调控可卡因诱导的神经元树突重构。另外有研究报道,可卡因可通过在Ser408/444位点磷酸化MEF2信号,从而抑制MEF2的活性,进而诱导NAc区的神经元发生树突重构,并最终导致行为学的变化。同时,这一研究还发现在可卡因施用过程中,D1信号可以调节MEF2的活性。可卡因诱导的神经元树突分支及树突棘密度发生可塑性变化是多种信号通路参与的结果。本研究分三部分,拟进一步深入探讨可卡因成瘾诱导的神经元树突重塑的分子机制。主要方法如下:第一部分,我们构建了 Rac1的无活性突变体慢病毒(Rac1N17)。利用GST-pull down技术探讨了 7天和28天可卡因处理之后,小鼠(每组9只)纹状体伏核(NAc)和纹状体尾壳核(CPu)区Rac1的活性变化,并利用Western-blotting技术对Rac1的上下游分子Tiam1、RacGAP1、Cofilin的活性进行了检测。通过脑立体定位注射技术将Rac1N17注入到小鼠脑CPu区(每组6只小鼠),恢复14天后,构建5天和28天可卡因成瘾模型,分别检测小鼠CPu区表达慢病毒的神经元树突分支和树突棘密度的变化;同时利用行为学敏化实验(每组8-9只小鼠)和条件性位置偏爱实验(每组9-12只小鼠)检测CPu区表达Rac1N17的小鼠及用Rac1特异性阻断剂NSC23766预处理的小鼠在可卡因诱导下其行为学的变化。第二部分,我们选用T29-1系CamKⅡ启动的Cre基因修饰小鼠与LoxP-Cdc42-LoxP小鼠进行杂交,构建了前脑特异性的Cdc42基因敲除小鼠,由于T29-1系列基因修饰小鼠的敲除区域主要在海马CA1区的椎体神经元,在CA1区的敲除率达到98%,因此,本部分的研究主要聚焦在海马CA1区。通过PCR技术、Nissl染色、免疫组化染色、Golgi-cox染色对其基因型和形态学进行了基本的检测(每组4-6只小鼠)。利用野生型小鼠构建慢性可卡因成瘾模型,通过GST-pull down技术检测了可卡因作用之后海马区Cdc42的活性变化(每组9只小鼠),并利用前脑特异性Cdc42基因敲除小鼠和野生型小鼠作对照,构建慢性可卡因成瘾模型,通过Golgi-cox染色方法检测了可卡因作用之后海马CA1区神经元树突棘密度的变化(每组5只小鼠)。第三部分,采用biocytin染色方法对可卡因诱导的发生树突重塑的神经元进行染色,并利用biocytin、D1和D2免疫荧光共定位技术研究可卡因诱导的发生树突重塑的神经元在神经元种类中的定位情况(雌、雄小鼠各14只)。在本课题组前期研究的基础上,通过利用D1、D3、NMDA、ERK特异性抑制剂阻断上述信号通路,探究该信号通路在调节可卡因诱导的神经元树突重构的过程中,是否是通过MEF2信号通路起作用的(每组4-6只小鼠)。以上三部分工作共同揭示毒品成瘾过程中神经元树突重塑可能的分子机制。主要结果如下:第一部分:1.在7天和28天的可卡因作用之后,分别在可卡因最后一针的15min、45min、2h、4h、8h、24h时间点取材,应用GST-pulldown技术研究NAc和CPu区Rac1-GTPase的活性变化。同时,对NAc和CPu区Rac1的上下游分子Tiaml、RacGAP1和Cofilin的活性进行了检测。结果显示:7天和28天的可卡因处理后,NAc 区的 Rac1-GTPase 活性下降(7 天:F=167.058,P0.001;28 天:F=84.001,P0.001),而 CPu 区的 Rac1-GTPase 活性升高(7 天:F=31.188,P0.001;28 天:F=35.557,P0.001);在 NAc 区,Rac1 的上游分子 Tiam1活性下降(7 天:F=37.263,P0.001;28 天:F=4.415,P=0.010),而 RacGAP1的活性上升(7 天:F=138.118,P0.001;28 天:F=35.085,P0.001),在CPu 区,Rac1 的上游分子 Tiam1 活性上升(7 天:F=65.944,P0.001;28天:F=19.761,P0.001),而 RacGAP1 的活性下降(7 天:F=22.861,P0.001;28 天:F=29.756,P0.001),NAc 和 CPu 区 Tiam1 和 RacGAP1 的变化趋势Rac1-GTPase活性变化相协调,提示可卡因通过调节NAc和CPu区Tiam1和RacGAP1活性,来调节Rac1-GTPase的活性;与此同时,我们还发现,Rac1的下游效应分子Cofilin在NAc区磷酸化水平下降(7天:F=84.420,P0.001;28天:F=56.437,P0.001),即活性升高,对骨架蛋白的剪切作用上升,在CPu区磷酸化水平上升(7天:F=5.191,P=0.007;28天:F=48.762,P0.001),即活性下降,对骨架蛋白的剪切作用下降。这些结果提示,可卡因可能是通过Rac1信号通路诱导神经元发生结构重塑的。2.应用CPu区立体定位注射RacN17慢病毒以探究CPu区Rac1是否参与了可卡因诱导的神经元树突重塑。小鼠CPu立体定位注射慢病毒后14天,制备5天和28天可卡因成瘾模型。利用biocytin染色显示小鼠CPu区表达Rac1N17的神经元的树突分支和树突棘密度。结果显示:Rac1N17可显著抑制5天和28天可卡因诱导的CPu区神经元树突分支的增多(F=73.109,P0.001),并且Rac1N17不影响基础水平的树突分支数量(5天:t=0.392,P=0.703;28天:t=0.652,P=0.529),同时,经过28天处理的小鼠整体比5天处理的小鼠树突分支数增多(F=51.922,P0.001),可能是两组小鼠开始时间处理一致,结束处理时间不一致,两组小鼠年龄不同所导致的。另外,Rac1N17可显著抑制可卡因诱导的CPu区神经元树突棘密度的增加(F=54.848,P0.001),并且Rac1N17可降低基础水平的神经元树突棘密度(F=54.848,P0.001)。其中,5天可卡因处理主要诱导thin spine密度的上升(F=28.968,P0.001),且Rac1N17的抑制作用也主要体现在thin spine密度的下降(F=28.968,P0.001);而28天可卡因处理诱导thin spine(F=28.968,P0.001)、stubby spine(F=8.793,P0.001)和mushroom spine(P=20.395,P0.001)的密度都出现上升,且Rac1N17的抑制作用也体现在thin spine(F=28.968,P0.001)、stubby spine(F=8.793,P0.001)和mushroom spine(F=20.395,P0.001)的密度都出现下降。提示,CPu区Rac1参与介导可卡因诱导的神经元树突重塑。3.应用CPu区表达Rac1N17的小鼠及用Rac1特异性阻断剂NSC23766预处理的小鼠研究Rac1在可卡因诱导小鼠行为学变化中的作用。小鼠CPu立体定位注射慢病毒后14天,检测可卡因诱导的行为学变化,结果显示:RacN17可显著降低小鼠对可卡因侧的偏爱(t=2.530,P=0.019),而对可卡因诱导的小鼠的行为学敏化没有影响(F=0.012,P=0.913)。其次,我们在可卡因之前30分钟注射NSC23766,检测可卡因诱导的小鼠行为学的变化,结果显示:NSC23766可显著降低小鼠对可卡因侧的偏爱(t=2.291,P=0.044),同时有降低可卡因诱导的小鼠的行为学敏化的趋势。这提示Rac1参与了可卡因诱导小鼠行为学的变化。第二部分:1.我们选用T29-1系CamKⅡ启动的Cre基因修饰小鼠与LoxP-Cdc42-LoxP小鼠进行杂交,构建前脑特异性的Cdc42基因敲除小鼠。PCR检测结果显示,我们构建的小鼠含有Cre基因,并且LoxP-Cdc42-LoxP基因为纯合子,提示我们成功构建了前脑特异性的Cdc42基因敲除小鼠。利用Nissl染色对3月大及6月大的前脑特异性的Cdc42基因敲除小鼠的海马区进行染色,我们发现,基因敲除小鼠与相应年龄的野生型小鼠相比,其海马的基本形态没有显著差异。利用Cdc42免疫组化染色对3月大和6月大基因敲除海马区进行染色,我们发现,3月大小鼠的基因敲除区域主要集中在CA1区和CA3区,而6月大小鼠基因敲除区域分布在整个海马区,包括CA1、CA3和DG区。利用Golgi-cox染色对3月大及6月大的前脑特异性的Cdc42基因敲除小鼠的海马区神经元进行染色,我们发现基因敲除小鼠较相应年龄的野生型小鼠相比,其海马CA1区神经元的树突棘密度出现了显著下降(3月:t=9.848,P0.001;6月:t=9.600,P0.001)。提示,海马CA1区Cdc42的敲除可降低CA1区神经元树突棘密度的基础水平。2.对野生型小鼠腹腔注射可卡因,制作28天可卡因成瘾模型,在最后一针可卡因后的15min、2h、8h时间点取材,运用GST-pulldown技术探测可卡因对海马区Cdc42-GTPase活性的影响。结果显示,慢性可卡因可激活海马区Cdc42-GTPase的活性,在15min升高,2h达到最高,8h回到基础水平(F=187.121,P0.001),提示可卡因可激活海马区Cdc42-GTPase的活性。3.取3月大和6月大脑特异性的Cdc42基因敲除小鼠制作28天可卡因成瘾模型,运用Golgi-cox染色对小鼠海马CA1区神经元树突棘进行显色。结果显示,在3月和6月的野生型小鼠中,可卡因可诱导CA1区神经元树突棘密度显著增加,而CA1区Cdc42基因的敲除可显著抑制可卡因诱导的CA1区树突棘密度的增加(3 月:F=165.847,P0.00];6 月:F=120.434,P0.001)。提示,Cdc42参与可卡因诱导的CA1区神经元树突重塑。第三部分:1.运用biocytin染色对可卡因诱导的发生树突重塑的神经元进行染色,与传统的Golgi-cox染色相比,biocytin染色能更清晰的显示出神经元树突分支(F=34.13,P0.00])和树突棘密度(F=9.97,P0.00])的变化,且可卡因诱导的神经元树突棘密度的增加存在显著的性别差异(F=33.49,P0.001),即雌性小鼠在可卡因诱导之后,其树突棘密度显著高于雄性小鼠的树突棘密度。运用biocytin与D1、D2免疫荧光共定位染色,我们发现,可卡因诱导的神经元树突重构在D1、D2和D1/D2共定位的神经元中都有发生,且这种分布不存在性别差异(χ2=0.011,P=0.994)。2.运用昆明小鼠制作7天可卡因成瘾模型,在最后一针的4h、12h、24h、48h、72h时间点取材,对NAc和CPu区磷酸化MEF2蛋白进行免疫组化染色,结果显示,可卡因可诱导NAc和CPu区MEF2的磷酸化水平,在4h开始升高,24h 升至最高,72h 降至基础水平(NAc:F=1351.608,P0.001;CPu:F=922.497,P0.001)。分别给予昆明小鼠D1、D3、NMDA和ERK通路抑制剂SCH23766、NGB2904、MK801和SL327进行预处理后,制作7天可卡因成瘾模型,在24h时间点取材,观察NAc和CPu区MEF2的磷酸化水平,结果显示,NGB2904可显著升高可卡因诱导的MEF2的磷酸化水平,而SCH23766、MK801和SL327可显著抑制可卡因诱导的MEF2的磷酸化水平(NAc:F=1893.723,P0.001;CPu:F=1088.314,P0.001),同时,以上几种抑制剂的单独使用并不影响MEF2的基础磷酸化水平(NAc:F=1.387,P=0.254;CPu:和2.330,P=0.070)。运用免疫荧光共定位染色,我们发现,可卡因诱导的MEF2的磷酸化与D1受体神经元共定位。结合课题组前期的研究,我们得出,可卡因可通过D1和D3受体,调控NMDA受体,进而调控ERK的活性,进一步调控MEF2的磷酸化水平,最终对神经元的树突重构起到相反的调控作用。通过上述研究,我们可以得出结论:(一)CPu区的Rac1信号通路参与可卡因诱导的神经元结构重塑和行为学的可塑性变化。(二)成功构建了前脑特异性的Cdc42基因敲除小鼠,并利用其探讨出CA1区Cdc42的活性参与介导可卡因诱导的CA1区神经元树突棘密度的增加。(三)可卡因诱导的神经元结构重塑存在性别差异。可卡因诱导的神经元结构重塑发生于D1、D2和D1/D2共定位的神经元中。且D1和D3受体信号通路相反的调控可卡因诱导的NAc和CPu区MEF2的磷酸化水平。综上所述,本研究采用一系列无活性突变体慢病毒、基因敲除技术、特异性信号通路阻断剂,通过阻断CPu区Rac1的活性、海马CA1区Cdc42的表达、D1和D3信号通路的活性,探究了CPu区的Rac1信号通路、海马CA1区Cdc42的活性、D1和D3信号通路在可卡因诱导的神经元树突重构及行为学可塑性变化中的作用。结果表明,CPu区的Rac1信号通路、海马CA1区Cdc42的活性、D1和D3信号通路参与了可卡因诱导的神经元树突重构,这提示可卡因诱导的神经元树突重构是多种信号通路共同作用的结果。上述研究对于我们深入了解可卡因成瘾的分子机制有重要的意义,同时也为可卡因成瘾的临床治疗提供了诸多启示。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R749.64

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本文编号：1478803