MRTF-A对Tg2576小鼠脑神经元凋亡和自噬的影响及机制研究

发布时间：2018-03-30 23:11

  本文选题：MRTF-A　切入点：海马　出处：《武汉科技大学》2016年硕士论文

【摘要】：目的本研究通过构建包装MRTF-A的慢病毒载体,并微量注射到Tg2576小鼠海马区,探讨MRTF-A对Tg2576小鼠学习记忆功能以及对海马神经细胞凋亡和自噬的影响及机制。方法第一部分MRTF-A对Tg2576小鼠学习记忆功能影响研究1.Tg2576小鼠学习记忆功能与内源性MRTF-A水平相关性研究分别选取野生型C57BL小鼠和Tg2576小鼠各10只,适应性饲养7天后以Morris水迷宫和条件恐惧实验进行动物行为学测评,随后取新鲜海马组织,分别以Real-time PCR和Western blot技术检测MRTF-A的m RNA和蛋白表达。2.过表达MRTF-A对Tg2576小鼠学习记忆功能的影响构建携带小鼠MRTF-A(滴度为2×108TU/ml的慢病毒载体),将Tg2576小鼠随机分为6组,每组6只,分别于侧脑室注射慢病毒液1μl、2μl、4μl,另设一组注射同等体积的阴性慢病毒的作为对照组。以侧脑室注射日为0天,在注射后第7天取小鼠新鲜脑组织做石蜡切片,用激光共聚焦显微镜观察不同剂量的慢病毒感染小鼠海马区基因的表达。根据表达结果选取最适剂量行侧脑室注射,分别检测侧脑室注射慢病毒后第7、14、21、28天后海马区的MRTF-A浓度,同时以条件恐惧实验和旷场实验测定其学习记忆功能。第二部分MRTF-A对Tg2576小鼠海马区神经元凋亡及自噬的影响及机制研究1.过表达MRTF-A对Tg2576小鼠脑组织神经元凋亡和自噬的影响实验小鼠随机分为对照组、模型组、实验组,对照组为野生型C57BL小鼠,模型组和实验组采用Tg2576小鼠。对照组和模型组侧脑室注射4μl的阴性慢病毒,实验组注射4μl的MRTF-A慢病毒液。注射后第28天取脑组织石蜡切片做HE染色观察脑细胞形态学变化,透射电镜观察海马区自噬小体的生成。2.过表达MRTF-A对Tg2576小鼠脑组织海马区神经元自噬及凋亡相关基因的影响分组及动物处理同第三部分,侧脑室注射慢病毒后第28天取新鲜海马组织,Real-time PCR和Western blot技术分别检测凋亡相关基因Bcl-2、mcl-1的m RNA和蛋白表达,自噬相关基因Atg5、Beclin1、Atg7的m RNA表达、及Beclin1和LC3的蛋白表达。结果1.MRTF-A对Tg2576小鼠学习记忆功能影响研究:(1)Tg2576小鼠学习记忆能力缺陷及海马MRTF-A表达水平:与同周龄的野生型C57BL/6J小鼠相比,Tg2576小鼠在Morris水迷宫中到达平台的时间延长,条件恐惧测试中Tg2576小鼠恐惧不动时间百分比低于野生型C57BL小鼠(P0.01)。取海马组织检测MRTF-A表达,发现Tg2576小鼠内源性MRTF-A水平低于野生型小鼠,有显著统计学差异(P0.01)。(2)过表达MRTF-A可缓解Tg2576小鼠的学习记忆障碍:过表达MRTF-A可缓解Tg2576小鼠的学习记忆障碍:侧脑室注射慢病毒1μl荧光表达较弱,2μl和4μl剂量下可见明显的荧光表达,4μl剂量组荧光表达水平明显高于其它组。故选取4μl作为进一步研究海马注射剂量。4μl MRTF-A慢病毒小鼠脑内注射后,与阴性对照组相比,慢病毒注射组MRTF-A表达水平在注射后第7天达到最高,到第28天缓慢降低,但仍然高于同期野生型C57BL小鼠脑内的表达水平。慢病毒侧脑室注射一周后,小鼠每隔7天进行一次旷场实验和环境条件恐惧记忆检测发现,过表达MRTF-A之后小鼠旷场实验运动总距离没有明显变化,第28天时中央格停留时间缩短,而第28天后Tg2576小鼠条件恐惧实验中恐惧不动时间百分比相比于对照组明显提高。2.过表达MRTF-A对Tg2576小鼠海马区神经元凋亡及自噬的影响及机制研究:(1)将4μl的慢病毒注射入Tg2576小鼠侧脑室后第28天行海马组织HE染色发现,过表达MRTF-A能明显减轻Tg2576小鼠海马神经细胞缺失及细胞核固缩情况;透射电镜观察海马区自噬小体生成情况发现,LV-MRTF-A处理后Tg2576小鼠海马区可见发现有双层膜环绕形成的自噬泡。(2)过表达MRTF-A上调凋亡相关基因Bcl-2、mcl-1的m RNA和蛋白表达,同时自噬相关基因Atg5、Atg6、Atg7的m RNA表达升高,LC3Ⅰ蛋白向LC3Ⅱ蛋白转化增多,Beclin1蛋白表达上调。结论随着Tg2576小鼠学习记忆能力缺陷的发生,其海马区MRTF-A的表达处于低水平状态。脑组织过表达MRTF-A可改善小鼠的学习记忆障碍。其机制可能通过MRTF-A上调抗凋亡基因Bcl-2、mcl-1和自噬相关基因Atg5、Atg6、Atg7的表达,从而抑制Tg2576小鼠海马区神经元凋亡,上调神经元自噬水平有关。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：武汉科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R749.16

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