Aβ42诱导线粒体自噬及其生物学效应研究

发布时间：2018-04-18 11:09

  本文选题：阿尔茨海默病 + β淀粉样蛋白　； 参考：《北京交通大学》2017年硕士论文

【摘要】：目的:阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一种进行性中枢神经系统变性病,其病因及发病机制尚未阐明。前期工作提示,AD可能与线粒体自噬相关,但是生物学效应和机制均不清楚。本文旨在研究Aβ诱导的线粒体自噬及其生物学效应。方法:(1)质粒的构建。首先从神经瘤母细胞(N2a)中提取总RNA,反转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)得到微管相关蛋白 1 轻链 3(microtubule-associatedprotein 1 lightchain3,MAP1LC3或LC3)基因,构建pEGFP-C1-LC3和pEGFP-N1-LC3质粒;(2)Aβ诱导线粒体自噬生物学效应的检测。利用荧光显微镜研究Aβ诱导自噬EGFP-LC3荧光斑点的效应,并研究了剂量、时间和Aβ聚集程度的依赖性;Western blot检测LC3BⅡ/LC3BI 和 p62 水平;通过透射电镜(transmission electron microscopy,TEM)及免疫电镜(immunoelectron microscopy,IEM)确定自噬小体的超微结构;(3)线粒体动力相关蛋白1(dynamin-related protein 1,Drp1)调控Aβ线粒体自噬的研究。以10 μmol/L的Aβ4242处理U87 MG细胞,qPCR确定Drp1的RNA水平变化;Western blot检测Drp1蛋白表达量的变化;通过siRNA下调Drp1表达水平,用Western blot检测Drp1、LC3BⅡ/LC3BⅠ和p62表达量的变化;用TEM观察线粒体形态及结构的变化;用MTT检测伴随的细胞活力改变的情况。结果:(1)获得了质粒pEGFP-C1-LC3和pEGFP-N1-LC3克隆,并成功转染神经胶质瘤U87MG细胞;(2)明确了 Aβ诱导线粒体自噬的生物学效应。Aβ处理pEGFP-C1-LC3转染的U87 MG细胞,荧光显微镜检测发现Aβ可以诱导细胞出现明显的LC3荧光斑点,并且具有剂量、时间以及聚集程度的依赖性;在超微结构水平,TEM提示Aβ诱导线粒体自噬的出现;经3MA阻断早期线粒体自噬后,与空白对照组相比,LC3BⅡ/LC3BⅠ的比值增加,同时p62的表达水平也增加了,提示3MA在抑制自噬的同时,也抑制了 LC3B的降解;(3)Drp1调控Aβ42线粒体自噬的机制。首先,qPCR及Western blot结果显示,Aβ处理细胞后,Drp1在RNA和蛋白水平都是下降的;TEM结果显示,与空白对照组相比,Aβ42诱导线粒体自噬,线粒体的形态较大且伴有线粒体损伤(膜损伤、线粒体嵴肿胀等)。其次,当特异性siRNA降低Drp1的表达水平后,发现LC3BⅡ/LC3BⅠ的比值增加,p62的表达量下降,说明Drp1的下调促进了自噬通量;最后,MTT结果显示,与空白对照组相比,Aβ42诱导线粒体自噬对细胞具有毒性作用。结论:本研究确定了 Aβ42诱导线粒体自噬模型条件,并在细胞水平证实了Aβ42诱导线粒体自噬的生物学效应,进而研究了 Drp1与Aβ42诱导的线粒体自噬之间调控的关系,为进一步探讨线粒体自噬在AD病理中的作用机制奠定了基础。
[Abstract]:Objective: Alzheimer's disease (AD) is a progressive central nervous system disease and its etiology and pathogenesis have not been elucidated.Previous work suggests that AD may be associated with mitochondrial autophagy, but the biological effects and mechanisms are unclear.The aim of this study was to study A 尾 -induced mitochondrial autophagy and its biological effects.Methods the plasmid was constructed.Firstly, total RNAs were extracted from neuroblastoma cells (N2a) and reverse transcription polymerase chain reactions-reverse polymerase chain reaction (RT-PCR) were used to obtain the microtubule-associated protein 1 light chain 3(microtubule-associatedprotein 1 lightchain3MAP1LC3 or LC3) gene. PEGFP-C1-LC3 and pEGFP-N1-LC3 plasmids were constructed to detect the biological effects of mitochondrial autophagy induced by pEGFP-C1-LC3 and pEGFP-N1-LC3 plasmids.The effects of A 尾 -induced fluorescent spots on autophagy EGFP-LC3 were studied by fluorescence microscope. The concentration of LC3B 鈪，

本文编号：1768124