口服益生菌对慢性轻度应激致小鼠类焦虑、抑郁行为的干预作用及肠-炎症-脑轴影响的研究

发布时间：2020-05-08 00:43

【摘要】：目的:探讨复合菌种(Lactobacillus helveticus R0052+Lactobacillus plantarum R1012+Bifidobacterium longum R0175)益生菌的抗焦虑抑郁作用,分析其对肠道菌群结构及组成成分、血清和海马炎症因子,以及海马吲哚胺2,3-双加氧酶-1(indoleamine 2,3-dioxygenase-1,IDO1)的影响,从而探讨益生菌潜在的抗焦虑抑郁机制。方法:1、实验动物分组:采用慢性不可预知温和应激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)连续4周构建抑郁小鼠模型,益生菌选取的是复合菌种(Lactobacillus helveticus R0052+Lactobacillus plantarum R1012+Bifidobacterium longum R0175)冻干粉,以选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(Selective Serotonin Reuptake Inhibitor,SSRI)氟西汀为阳性对照药物。6-8周龄雄性C57BL/6J小鼠随机分为6组:慢性应激+安慰剂组(CUMS+NS),慢性应激+氟西汀组(CUMS+F),慢性应激+益生菌组(CUMS+P),对照+安慰剂组(CON+NS),对照+氟西汀组(CON+F)和对照+益生菌组(CON+P)。通过灌胃的方式给予对应的药物。CUMS+P和CON+P每日给予益生菌2×10~9 CFU(0.2 mL),CUMS+F和CON+F每日给予氟西汀18 mg/kg,CUMS+NS和CON+NS组每日给予生理盐水0.2 mL,慢性应激组给药的同时施加应激程序,对照小鼠除了喂食、清洁笼子和给予对应药物外,不给予其他任何应激。2、行为学测试:每周进行小鼠体重的测定;4周造模及药物干预结束后采用庶糖偏好实验、旷场实验、高架十字迷宫实验、强迫游泳实验,来评估小鼠焦虑抑郁样行为的变化。3、肠道微生物菌群分析:盲肠内容物利用16S rDNA测序,并进行beta多样性分析、alpha多样性分析和物种丰度分析,来评估小鼠肠道微生物菌落结构及组成的变化。4、炎症因子指标:采用ELISA法测定血清和海马组织中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)、干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)、白介素(interleukin,IL)-6、IL-10水平。5、海马吲哚胺2,3-双加氧酶-1(indoleamine 2,3-dioxygenase-1,IDO1)蛋白表达:采用Western-Blotting法检测海马IDO1蛋白表达水平。结果:1、4周CUMS诱导小鼠产生显著的焦虑抑郁样行为。与对照组相比,CUMS小鼠体重增长显著减慢(P0.05)。4周CUMS造模后小鼠蔗糖偏好指数显著降低(P0.05),旷场实验中CUMS使小鼠在中心区域停留时间明显减少(P0.05);高架十字迷宫实验中小鼠进入开放臂停留时间显著缩短(P0.05);强迫游泳实验的不动时间显著增加(P0.05)。氟西汀干预可以完全逆转这种慢性应激引起的行为学变化,表现为:与CUMS+NS相比,CUMS+F组蔗糖偏好指数明显升高(P0.05);旷场实验的中心区域停留时间显著增加(P0.05);明显缩短了高架十字迷宫实验中的进入开放臂停留时间(P0.05)以及强迫游泳时小鼠的不动时间(P0.05)。益生菌(Lactobacillus helveticus R0052+Lactobacillus plantarum R1012+Bifidobacterium longum R0175)部分逆转了慢性应激引起的行为学变化,表现为:与CUMS+NS相比,CUMS+P组旷场实验的中心区域停留时间显著增加(P0.05);明显缩短了高架十字迷宫实验中的开放臂停留时间(P0.05)和强迫游泳时的不动时间(P0.05),益生菌干预虽对蔗糖偏好指数无统计学差异,但有提高趋势。2、从beta多样性分析来看,CUMS使小鼠肠道菌群落结构发生显著改变。从alpha多样性分析来看,CUMS造模后指数Chao1和Simpson显著升高(P0.05),肠道菌群具有更高的多样性和物种均匀性。另外分别在门、纲、目、科、属分类等级进行物种丰度的分析。结果显示:48个样品肠道微生物物种注释主要归属于4个门:分别是厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)和变形菌门(Proteobacteria),这4个菌门占到了总序列的(96.94±2.04%)。通过Kruskal-Wallis检验分析发现:CUMS对小鼠肠道菌群中厚壁菌门、拟杆菌门、疣微菌门和变形菌门的相对丰度无显著影响。CUMS造模后,CUMS+NS与CON+NS相比,在纲水平,Bacilli相对丰度明显减少(P0.05),而Erysipelotrichia和Betaproteobacteria相对丰度明显增加(P0.05)。在目水平,Lactobacillales相对丰度明显减少(P0.05),而Erysipelotrichales和Burkholderiales相对丰度明显增加(P0.05);在科水平,Lactobacillaceae相对丰度明显减少(P0.05),而Ruminococcaceae、Prevotellaceae、Erysipelotrichaceae、Rikenellaceae和Sutterellaceae相对丰度明显增加(P0.05)。在属水平,Lactobacillus,Barnesiella相对丰度明显减少(P0.05),而Alloprevotella、Parasutterella及Parabacteroides相对丰度显著增加(P0.05)。补充益生菌后Bacilli纲,Lactobacillales目,Lactobacillaceae科,Lactobacillus属相对丰度明显增加(P0.05),而Prevotellaceae科,Alloprevotella和Parabacteroides属的相对丰度显著减少(P0.05)。3、炎症细胞因子测定结果显示,CUMS造模后,血清TNF-α水平以及海马IFN-γ,TNF-α水平显著升高(P0.05),且CUMS同时补充氟西汀或益生菌后,均可以使血清TNF-α和海马IFN-γ、TNF-α表达降低,具有统计学意义(P0.05)。4、Western Blotting结果显示CUMS+NS组小鼠海马中IDO1蛋白水平明显高于CON+NS组(P0.05)。补充益生菌或氟西汀可以显著降低海马中的IDO1蛋白水平(P0.05)。结论:CUMS小鼠的肠道菌群落结构和组成,外周血促炎细胞因子以及中枢海马促炎细胞因子和IDO1蛋白水平发生了明显的变化。复合菌种益生菌(Lactobacillus helveticus R0052+Lactobacillus plantarum R1012+Bifidobacterium longum R0175)通过对肠道微生态失调的调整作用,抑制外周血TNF-α水平及海马IFN-γ、TNF-α水平,直接或炎症因子介导的抑制海马IDO1表达,具有改善CUMS诱导焦虑和抑郁样行为的作用。肠道微生物-炎症-脑轴可能是复合菌种益生菌(Lactobacillus helveticus R0052+Lactobacillus plantarum R1012+Bifidobacterium longum R0175)抗焦虑抑郁效应的潜在作用机制。
【图文】：

图 1. 建立慢性不可预知温和应激模型时的刺激程序安排 动物分组及基本流程用随机数字表分组法进行分组，分为 6 组，每组 8 只，分别为：慢性应组（CUMS+NS），慢性应激+氟西汀组（CUMS+F），慢性应激+益生UMS+P），对照+安慰剂组（CON+NS），对照+氟西汀组（CON+F）和菌组（CON+P）。所有慢性应激组每日按图 1 施予应激程序，并灌胃给予预药物。对照三组除添加饲料和水，清洁鼠笼，灌胃对应的药物外，不施激刺激。28 d 后，所有小鼠均进行了连续 4 d 的行为学测试，之后处死，（图 2）。 实验药品益生菌选用的是复合菌种冻干粉（Lactobacillus helveticus R0052+Lactobatarum R1012+Bifidobacterium longum R0175）(加拿大拉曼公司) 每日用生

图 2. 实验设计方案。CUMS：慢性温和不可预知应激；SPT：庶糖偏好实验；OFT：旷场实验；EPM：高架十字迷宫；FST：强迫游泳；CUMS+NS：慢性应激同时给予生理盐水；CUMS+F：慢性应激同时给予氟西汀干预；CUMS+P：慢性应激同时给予益生菌干预； CON+NS：对照仅给予生理盐水；CON+F：对照给予氟西汀干预；CON+P：对照给予益生菌干预。2.4 行为学实验2.4.1 庶糖偏好实验（sucrose preference test，SPT）SPT 是用来评价啮齿类动物快感缺失的指标，快感缺失作为抑郁症的核心症状。SPT 一共进行两次：第一次，在实验开始前，作为基线，也作为训练测试；第二次，在 CUMS 4 周后（第 29 d），作为行为学测试的一部分。进行 SPT 时所有小鼠均单独饲养，并给予事先称重的两个水瓶，，分别装 1%（w/v）蔗糖溶液或自来水。每隔12 h 更换一次水瓶位置，以防止水瓶位置对实验的干扰。24 h 后，取走两个水瓶，通过称重水瓶，计算出小鼠的蔗糖消耗量、自来水消耗量[69]。蔗糖偏好指数%=蔗
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R749

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本文编号：2653820