SIRT1调控海洛因成瘾大鼠伏隔核突触可塑性的实验研究

发布时间：2020-07-18 01:43

【摘要】：成瘾被认为是一种病态的学习、记忆过程,表现为失控的主动寻药和强迫性用药行为。突触可塑性作为学习和记忆的神经生物学基础,在成瘾行为的发生发展过程中发挥重要作用。伏隔核(nucleus accumbens,NAc)是大脑奖赏系统的重要组成部分,参与机体认知活动、学习记忆相关行为活动,被认为是机体产生奖赏效应的主要核团。第Ⅲ类去乙酰化酶沉默信息调节因子2蛋白(Silent information regulator2 proteins,Sirtuins)以组蛋白和非组蛋白作为去乙酰化酶底物,调控基因转录,也参与可卡因、吗啡等精神兴奋类药物的成瘾形成。沉默交配型信息调节因子同源类似物1(Silent mating type information regulation 2homolog 1,SIRT1)是人类Sirtuins家族中研究最为广泛深入的蛋白,然而有关SIRT1在海洛因成瘾大鼠NAc中的相关研究鲜见报道。本实验通过建立海洛因成瘾大鼠模型,检测Sirtuins在海洛因成瘾大鼠NAc中的表达情况;包装含有目的基因Sirt1和沉默Sirt1基因的腺相关病毒,并对大鼠NAc进行微量注射转染,建立海洛因成瘾、SIRT1过表达以及SIRT1沉默大鼠模型,观察各组大鼠海洛因条件位置偏爱(conditioned place preference,CPP)的诱导情况和纳洛酮戒断等症状;利用PCR芯片技术检测海洛因成瘾大鼠,SIRT1过表达大鼠NAc中与突触可塑性相关的84个基因的表达变化;采用免疫组织化学和免疫蛋白印迹技术检测各组大鼠NAc中突触可塑性相关蛋白的定位和表达情况;用透射电镜对突触超微结构进行观察。以期阐明SIRT1在海洛因成瘾机制中的可能作用,以及调控SIRT1的表达对伏隔核突触可塑性的影响,为找寻戒毒或治疗成瘾寻找新的靶点。第一部分:Sirtuins在海洛因成瘾大鼠NAc脑区中的表达目的:通过建立大鼠海洛因成瘾模型,诱导大鼠海洛因条件位置偏爱(CPP)的形成,检测Sirtuins成员SIRT1-SIRT7在NAc脑区的表达情况。方法:(1)成年雄性sd(sprague-dawley)大鼠随机分为盐水对照组、海洛因成瘾组和纳洛酮戒断组。海洛因成瘾组按体重逐日递增腹腔注射海洛因药液,直至第9d成功建立大鼠成瘾模型;第10d注射纳洛酮催促戒断,观察并记录戒断症状之后处死动物。取各组大鼠nac脑区,分别用westernblot技术和实时荧光定量pcr技术检测sirt1、sirt2、sirt3、sirt4、sirt5、sirt6和sirt7蛋白和mrna的表达。(2)sd大鼠分为cpp组和盐水对照组,cpp组大鼠每日上午按照标准递增给予海洛因后放入白箱,下午注射相当剂量生理盐水放入黑箱进行训练连续9d;生理盐水组上、下午都给予生理盐水。最后记录大鼠在白箱的停留时间,检测海洛因诱导cpp的情况。结果:(1)海洛因成瘾组和生理盐水组经过连续注射海洛因或生理盐水9d后给予纳洛酮后,观察到海洛因成瘾组大鼠在纳洛酮作用下,出现明显的站立、跳跃、扭体、湿狗样抖、眼睑下垂、齿颤和腹泻等戒断症状(p0.05)。而生理盐水组未见明显戒断反应;(2)经过预测试期、训练期和测试期,给予海洛因组大鼠明显诱发cpp,其在白箱停留时间明显长于生理盐水对照组(p0.05)。(3)westernblot结果显示,海洛因成瘾大鼠nac脑区中sirt1蛋白的表达明显高于生理盐水组(p0.05),而sirt2-sirt7蛋白水平差异均无统计学意义。(4)qrt-pcr结果显示,海洛因成瘾大鼠nac脑区sirt1mrna水平显著升高,而sirt2-sirt7mrna表达在海洛因成瘾组和生理盐水组之间无明显差异。结论:在海洛因成瘾大鼠nac中,sirtuins家族的sirt1在蛋白和mrna水平能明显升高,提示sirt1参与了海洛因成瘾过程的形成。第二部分:sirt1对突触可塑性相关蛋白和基因表达的影响目的:通过建立不同的实验动物模型,观察大鼠行为学改变,检测突触可塑性相关蛋白和基因的表达情况,了解sirt1对各组大鼠nac脑区突触可塑性的影响,探讨突触可塑性与成瘾行为变化的可能关系。方法:包装raav9-rsirt1和raav9-rsirt1shrna腺相关病毒,利用转染技术,建立海洛因成瘾组、sirt1过表达组、sirt1沉默组大鼠模型;观察纳洛酮戒断症状和cpp变化;利用pcr基因芯片技术检测海洛因成瘾大鼠和sirt1过表达大鼠nac脑区中与突触可塑性相关的84个基因的表达变化;应用免疫组织化学和图像分析技术检测SIRT1作用底物总体乙酰化组蛋白H3(Acetyl-Histone H3,Ac-H3)以及一些非组蛋白底物(Cdk5,NF-κB等)的定位和平均光密度;运用Western blot技术检测突触可塑性相关蛋白的表达;透射电镜观察突触的超微结构变化。结果:(1)成功构建质粒,包装含目的基因和沉默目的基因的腺相关病毒并完成病毒转染;(2)CPP行为学实验结果表明,盐水对照组和单纯病毒组大鼠训练前后在伴药箱停留时间无明显差异,海洛因成瘾组、SIRT1过表达组大鼠经训练后在伴药箱停留时间明显长于训练前(P0.05),海洛因CPP诱导成功。SIRT1沉默组大鼠在伴药箱停留时间长于训练前,但较成瘾和过表达组有明显降低(P0.05)。(3)纳洛酮戒断症状明显出现在海洛因成瘾组和过表达组,尤以过表达最为典型;沉默组戒断症状有所减轻;(4)免疫组织化学和Western blot结果显示SIRT1作用底物:Ac-H3和FOXO1在海洛因成瘾组表达降低(P0.05),SIRT1过表达时进一步降低,SIRT1沉默组表达有所升高(P0.05);Cdk5、NF-κB、PSD95、Syn的表达的在海洛因成瘾组表达增强(P0.05),SIRT1过表达时进一步升高,SIRT1沉默组表达有所下降(P0.05);△FosB的表达在海洛因成瘾组、SIRT1过表达组和SIRT1沉默组表达均升高(P0.05),但三组之间差异不具有统计学意义。(5)透射电镜观察海洛因成瘾组大鼠和SIRT1过表达组大鼠NAc中突触数量有所增加(P0.05),突触结构不清晰,突触前膜内线粒体有肿胀,突触间隙增宽,突触后膜致密物增厚。结论:(1)NAc脑区SIRT1与突触可塑性相关基因参与了调节海洛因成瘾的过程。(2)NAc脑区SIRT1过表达增强了大鼠的行为敏化,而SIRT1沉默组减轻海洛因成瘾大鼠的戒断症状和CPP,有助于为戒毒治疗寻找新的有效靶点。
【学位授予单位】：贵州医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R749.64
【图文】：

贵州医科大学 2017 届科学学位博士研究生学位论文区(ventral tegmental area,VTA)、伏隔核(nucleus accumbens,NAc)、前额prefrontal cortex,PFC）是脑内产生奖赏效应的主要核团[10]。NAc主要中脑边缘系统腹侧被盖区（VTA）多巴胺神经元(dopamine, DA)投射传汇集前额叶皮层、海马、杏仁核等部位兴奋性谷氨酸能神经元的传入末同来源的信息经过整合后通过传出神经元支配基底神经节参与认知活动感、学习记忆相关行为活动。此外NAc中的大量中等树突棘神经元的信能投射回PFC和中脑多巴胺系统[11]（图1-1）。NAc是一个信息整合、协调成瘾相关的行为学改变中起着至关重要的作用，是许多成瘾性药物的。

贵州医科大学 2017 届科学学位博士研究生学位论文 25 cm × 30 cm × 70 cm）。箱内有两块高 30 cm 的可抽取隔板将箱部分。实验箱位于箱体两侧，一黑一白，是两个大小相同的正方体壁皆为白黑相间条纹，底面刻有条纹；黑箱内四壁皆为黑色，底之间有一个较小的中间箱。当隔板抽出时，大鼠可以在三个箱子之当隔板插入时，可将动物限制在某一个箱子里。每个箱顶端都安装头与计算机相连，可以记录动物在各箱中的停留时间。整个实验过风，箱内的光线、气味等环境条件一致。

图 1-5 蛋白含量标准曲线Fig1-3 The standard curve of protein content从图1-3可以看出，蛋白浓度与吸光度呈现较好的的线性关系，OD值)绘制标准曲线，从而计算样品中的蛋白含量。3） 注意事项：a.在BCA工作液配制过程中，应防止A液和B液的相互污染。工，应在24小时内完成实验。配制好后立即加盖，且整个过程严b.每个蛋白梯度和样品均做复孔，每次都应做标准曲线，这样的蛋白浓度。4）Western blot 检测：1）制备十二烷基磺酸钠——聚丙烯酰胺(SDS-PAGE) 凝胶：装好玻璃板，根据目的蛋白分子量大小按照凝胶配制比例（表制相应浓度的分离胶，充分混匀后灌入凝胶玻璃槽中（灌胶时沿

【参考文献】

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本文编号：2760226