【摘要】：水通道蛋白(Aquaporins,AQPs)是一组广泛存在于动植物细胞膜上,参与机体内水转运相关的膜整合蛋白,主要作用于水分子的跨膜及调节细胞内环境稳态,目前哺乳动物体内已鉴定出13种水通道蛋白AQPO-AQP12[1,2]。其中AQP4在调节细胞的稳态,钾离子的清除,以及水平衡上具有重要的作用。近几年研究发现AQP4在垃圾的清理、细胞体积动力学、钾离子清除、神经元兴奋性、突触可塑性和行为、感应系统(视网膜、内耳)上都有着不同的作用。作为一种膜整合蛋白,除提供基础的水平衡外[3],自2003年开始就有人发现,抑制AQP4表达可以导致N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDA受体)失调,损坏长时程增强作用(Long-term Potentiation,LTP),这种LTP是由θ突发诱导,特异性的依赖于BDNF-TRKB受体[4](脑源性神经营养因子,brain derived neurotrophic factor,BDNF;酪氨酸激酶B,TRKB)。提示AQP4与神经营养因子之间存在相互联系。截至2019年,AQP4参与调节BDNF的具体机制研究还没有,主要是将AQP4导致的认知障碍与BDNF进行联系[5]。从2009年提出BDNF的“阴阳平衡假说”到2018提出的“连续分选假说”,提示我们需要从整体上来评价神经营养因子的作用[61,并且脑源性神经营养因子BDNF的作用不仅仅局限于mBDNF-TRKB信号偶联作用,其前体proBDNF对BDNF自身生成、分泌、剪切及整体上细胞存活,凋亡的调节也具有重要作用。同时暗示着在将来的抗抑郁和相关神经退行性疾病中,会选用新的靶点和治疗方式。但是目前对于proBDNF和mBDNF的研究较少,相对应的机制研究也很缺乏,2018年在《PNAS》和《Nature》上发表的关于BDNF信号传导以及信号整合的两篇文章,提示我们BDNF的信号传递伴随着多个蛋白的整合,BDNF的研究前景还有很多,但在许多领域仍然不清楚[7,8]。2005年Chen等人发现,sortilin和BDNF的前体结构域存在特异性结合[9],并且这样的复合物形成足以影响到BDNF在细胞内的分泌方式。2019年Jason等人发现改变分拣蛋白的剪接可以改变活性依赖性BDNF分泌,损害突触可塑性和认知行为[10],这些提示我们BDNF前体结构域在突触可塑性以及自身的分泌中具有不可忽视的作用。我们的研究首次发现小鼠AQP4敲除可以改变基础状态下海马皮层脑区BDNF表达,而在抑郁模型中,AQP4基因敲除鼠的BDNF表达与野生型对比,表现出特异性差异,这提示我们AQP4对BDNF的调节可以影响基础和疾病模型下BDNF的蛋白表达。根据AQP4在脑内的分布及定位特点,我们聚焦于AQP4调节星形胶质细胞BDNF成熟体表达的机制研究,以此来说明AQP4在脑内参与BDNF调节的相关机制。目的:探究AQP4在星形胶质细胞生成和分泌BDNF的过程中,调节BDNF前体及成熟体表达的具体机制研究。方法:本实验将雄性CD1/AQP4+/+和CD1/AQP4-/-小鼠各自随机分成三组,共六组:AQP4+/+正常对照组,AQP4+/+CMS模型组,AQP4+/+CMS抑郁模型+氟西汀治疗组,AQP4--正常对照组,AQP4--CMS模型组,AQP4-/-CMS抑郁模型+氟西汀治疗组。每只小鼠单笼饲养,对照组常规饲养,通过糖水测试观察是否造模成功。1.提取六组海马、皮层脑区组织蛋白,Western blotting检测组织中BDNF前体及成熟体的蛋白表达;2.培养原代星形胶质细胞,Western blotting检测细胞内BDNF前体及成熟体蛋白表达,4同时检测细胞分泌蛋白中BDNF前体蛋白表达;3.ELISA试剂盒检测星形胶质细胞胞内及胞外的BDNF含量;4.QPCR检测海马、皮层及星形胶质细胞神经营养因子mRNA的表达;5.Wesrtern blotting检测海马、皮层及原代星形胶质细胞BDNF上游启动因子β-catenin,CREB(环磷腺苷效应元件结合蛋白,cAMP-response element binding protein)及相应磷酸化表达;6.COIP检测星形胶质细胞及C8细胞株内分拣蛋白sortilin、AQP4与BDNF前体结构域之间的相互结合作用;7.使用钙探针fluo-3 am孵育星形胶质细胞,通过流式细胞技术检测两种基因型星形胶质细胞内钙离子的量,并检测给药后各基因型细胞内钙离子含量;8.使用TSA偶联的多重荧光染色-细胞技术,观察sortilin在两种基因型星形胶质细胞内与BDNF前体的结合效率。结果:1.AQP4基因敲除小鼠海马、皮层脑组织BDNF前体和成熟体蛋白表达异常在基础状态下,AQP4敲除导致小鼠海马、皮层区BDNF前体表达升高,成熟体表达降低(p0.05)。CMS造模后,AQP4+/+组海马、皮层区BDNF前体升高,成熟体降低(p0.05);而AQP4-/-组在CMS造模后海马、皮层区前体及成熟体未出现差异性变化,且取消了氟西汀的治疗作用。提示AQP4调节脑内BDNF前体及成熟体的表达。2.AQP4基因敲除导致星形胶质细胞胞内BDNF前体及成熟体蛋白表达异常在基础状态下,AQP4敲除导致原代星形胶质细胞胞内BDNF前体表达升高,成熟体表达降低(p0.05)。AQP4基因敲除未影响海马、皮层组织中BDNF mRNA水平及上游启动因子CREB、β-catenin自身和磷酸化表达。QPCR分别检测两种基因小鼠海马、皮层区营养因子BDNF、NGF、GDNF、CDNF的mRNA水平。发现AQP4敲除未影响各营养因子在海马、皮层区mRNA水平。同时在基础状态下,Western blotting检测BDNF上游启动因子β-catenin,CREB及其磷酸化。发现AQP4敲除对脑内β-catenin,CREB及其磷酸化水平无显著影响。3.AQP4基因敲除未影响星形胶质细胞内BDNF的生成QPCR检测星形胶质细胞BDNF mRNA表达,发现AQP4敲除及对照组的BDNF mRNA水平无显著差异。通过Western blotting检测BDNF上游启动因子β-catenin,CREB及其磷酸化水平均无显著差异。通过ELISA试剂盒检测,发现AQP4-/-星形胶质细胞胞内及胞外的BDNF总量与AQP4+/+组的BDNF总量经统计学分析无显著性差异。表明AQP4未参与星形胶质细胞BDNF的生成。4.AQP4基因敲除抑制星形胶质细胞向外分泌BDNF ELISA试剂盒检测给予饥饿刺激后6 h,12 h及24 h后的胞外BDNF含量,发现AQP4基因敲除导致星形胶质细胞向胞外分泌BDNF的量减少,从饥饿12 h开始出现显著性差异(p0.05)。Western blotting检测细胞上清蛋白,发现BDNF前体分泌减少(p0.01)。5.AQP4基因敲除导致星形胶质细胞分泌BDNF减少与细胞内钙离子含量相关AQP4敲除可以导致细胞上钙离子通道蛋白表达减少(实验室前期结果);给予NMDA、AMPA受体抑制剂可以恢复AQP4-/-星形胶质细胞BDNF分泌异常;钙离子通道阻断剂可以导致AQP4+/+星形胶质细胞BDNF分泌减少。通过流式细胞检测,在基础状态下AQP4敲除的星形胶质细胞胞内,钙离子含量高于对照组。NMDA、AMPA受体阻断剂给药后可以降低AQP4-/-星形胶质细胞胞内的钙含量,表明AQP4-/-星形胶质细胞因NMDA,AMPA受体过度活化导致细胞内钙离子水平过高。6.AQP4基因敲除抑制sortilin与BDNF前体结构域的结合AQP4-/-和AQP4+/+星形胶质细胞内sortilin的蛋白表达无显著差异。在基础状态下,AQP4-/-星形胶质细胞内sortilin与BDNF前体结构域的结合减少(p0.05)。表明AQP4抑制sortilin与BDNF前体结构域的结合。结论:AQP4基因敲除升高细胞内钙离子水平及减弱sortilin与BDNF前体的结合,抑制星形胶质细胞向外分泌前体BDNF。导致细胞间隙参与剪切的前体BDNF减少,最终导致成熟体生成减少,从而改变细胞及海马、皮层脑区中BDNF前体及成熟体的表达。
【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R749.1
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本文编号：2772091
