线粒体自噬在阿尔茨海默病细胞模型中的作用机制

发布时间：2020-08-06 10:53

【摘要】：背景：阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是一种以智能衰退、人格改变为主要临床表现的慢性中枢神经系统变性疾病,病程进行性发展。病理改变主要集中在颞、前额和顶叶,其中以海马改变最为明显,主要病理学特征为胞内过度磷酸化的tau蛋白所形成的神经元纤维缠结(neurofibrillary tangles. NFTs), β淀粉样蛋白(β-amyloid protein, Aβ)异常蓄积形成的老年斑(senile plaques, NPS)以及选择性神经元和突触脱失。在早发性家族性AD患者中涉及淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursor protein, APP)、早老素1(presenilin 1, PS1)、早老素2(presenilin 2, PS2)基因突变。但是AD发病的分子机制在很大程度上还不清楚,在神经元纤维缠结形成前细胞已经出现能量代谢障碍、ROS生成增加,说明线粒体功能障碍以及氧化应激是AD的早期事件,目前几种假说主要围绕AD发生发展的早期事件进行研究,旨在为该疾病提供一种早期有效的临床干预治疗。自噬是细胞清除损伤的细胞器和蛋白质的分解代谢过程,通过这一过程有助于细胞适应本身代谢需要和实现细胞器的更新。自噬主要包括巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬三种形式,按自噬是否具有选择性又可分为选择性和非选择性自噬。线粒体是真核细胞内进行能量转化的场所,在供给细胞能量的同时可以产生活性氧(ROS),过多的ROS可以引起蛋白质,核酸和脂肪酸过氧化,造成细胞损伤,因此及时清除损伤的线粒体对维持细胞正常生理功能具有重要作用。当细胞在饥饿、氧化应激、衰老等情况下,可以使细胞内线粒体发生去极化,去极化的线粒体被选择性的包裹进自噬体并与溶酶体结合,从而使损伤的线粒体得以清除的过程称为线粒体自噬。线粒体自噬属于选择性自噬。有研究表明,AD患者大脑神经元内存在线粒体数量减少、嵴破坏,线粒体功能障碍。Ap可以抑制细胞呼吸链和三羧酸循环的关键酶,使线粒体功能障碍,线粒体膜电位下降,线粒体肿胀、颗粒性状发生改变、ATP生成减少,ROS增多,造成细胞损伤。线粒体靶向丝氨酸/苏氨酸激酶PTEN诱导激酶1(PTEN inducible kinase 1, PINK1)和E3泛素连接酶Parkin通过调节膜电位,嵴结构,钙稳态,线粒体DNA的完整性和呼吸活动等一些生理过程来维持线粒体完整性。在正常的线粒体中,PINK1被迅速降解,当线粒体膜电位去极化后,PINKl才以电压依赖的方式在线粒体外膜上稳定表达。PINK1/Parkin途径是自噬相关清除不正常线粒体的关键。根据以上背景所述,本研究主要探讨在AD细胞模型中是否有线粒体自噬异常,线粒体自噬的作用机制是什么,PINK1和Parkin是否参与了线粒体自噬的调节。本研究旨在对AD发病早期事件——线粒体自噬的研究,为AD的早期临床干预及防治提供新的思路及方法。目的：探讨阿尔茨海默病细胞模型20E2中是否存在线粒体自噬异常,线粒体自噬的作用机制以及PINK1和Parkin是否参与了线粒体自噬的调节。为AD的早期临床干预提供新思路及方法。方法：1.将20E2细胞(稳定转染APPsw的HEK293细胞)作为实验组,HEK293细胞作为对照组在相同的培养条件下培养。2.应用ELISA法检测细胞上清Aβ1-40水平、Western blotting检测APP蛋白表达水平,确定20E2细胞是否建模成功。3.电镜下观察细胞内线粒体。4.JC-1检测两种细胞线粒体膜电位。5.流式细胞仪检测两种细胞凋亡情况。6. Western blotting检测LC3-Ⅱ、PINK1、Parkin表达水平。7.免疫荧光观察Parkin表达及线粒体定位情况。8. PINK1 siRNA处理细胞,Western blotting检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ表达水平。1.与HEK293细胞相比,20E2细胞APP蛋白、Aβ1-40表达增加(P0.05)。2.20E2较HEK293细胞线粒体肿胀、嵴消失、空泡化明显,线粒体膜电位下降。3.20E2细胞与HEK293细胞凋亡率无明显差别(P0.05)。4.与HEK293细胞相比,20E2细胞LC3-Ⅱ、 PINK1、Parkin表达增加(P0.05)。5.免疫荧光示20E2较HEK293细胞Parkin表达增加,线粒体定位明显。6.经PINK1 siRNA干扰后20E2细胞LC3 Ⅱ表达减少,说明PINK1/Parkin途径参与了20E2细胞线粒体自噬调节。结论：阿尔茨海默病细胞模型20E2线粒体形态改变明显、膜电位下降,线粒体自噬增加,PINK1 Parkin表达增加,经PINK1 siRNA处理后20E2细胞自噬较前减弱,研究结果表明AD细胞模型20E2这些改变可能通过PINK1、Parkin途径引起线粒体自噬增加。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R749.16
【图文】：

完全相同的条件下培养两种细胞，对数生长期的两种细胞电镜下观察细胞超逡逑微结构发现，２０Ｅ２细胞中线粒体较对照组改变明显，线粒体肿胀，空泡化线粒逡逑体峭断裂，正常形态消失，见图３。逡逑ＨＥＫ２９３逦２０Ｅ２逡逑图３电q<下观察线粒体形态逡逑３邋ＪＣ－１检测线粒体膜电位结果：逡逑采用完全相同的条件培养两种细胞，ＪＣ－１检测线粒体膜电位，正常情况下逡逑线粒体膜电位较高时，ＪＣ－１在线粒体基质形成聚合物，焚光显微镜下可Ｗ产生逡逑红色巧光；在线粒体膜电位较低时ＪＣ－１为单体，产生绿色英光。结果显示；２０Ｅ２逡逑细胞较对照组红色巧光减弱，绿色巧光增强，表明线粒体膜电位下降，见图４。逡逑３１逡逑

完全相同的条件下培养两种细胞，对数生长期的两种细胞电镜下观察细胞超逡逑微结构发现，２０Ｅ２细胞中线粒体较对照组改变明显，线粒体肿胀，空泡化线粒逡逑体峭断裂，正常形态消失，见图３。逡逑ＨＥＫ２９３逦２０Ｅ２逡逑图３电q<下观察线粒体形态逡逑３邋ＪＣ－１检测线粒体膜电位结果：逡逑采用完全相同的条件培养两种细胞，ＪＣ－１检测线粒体膜电位，正常情况下逡逑线粒体膜电位较高时，ＪＣ－１在线粒体基质形成聚合物，焚光显微镜下可Ｗ产生逡逑红色巧光；在线粒体膜电位较低时ＪＣ－１为单体，产生绿色英光。结果显示；２０Ｅ２逡逑细胞较对照组红色巧光减弱，绿色巧光增强，表明线粒体膜电位下降，见图４。逡逑３１逡逑

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本文编号：2782281