pBDNF对培养海马神经元的毒性作用及其对AD鼠学习记忆的影响
发布时间：2020-08-06 16:49
【摘要】：1.研究背景和意义脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)是神经营养因子家族中的一员,BDNF在中枢及周围神经系统中广泛分布,同时也表达于内分泌系统、骨和软骨组织等部位,但主要海马与皮层的含量最多。在神经元内,BDNF主要与酪氨酸蛋白激酶受体B(tyrosine kinase receptor B,TrkB)结合,激活细胞内信号通路,产生下游信号影响神经元。当BDNF与TrkB结合时,它促进细胞增殖、分化和存活,并有助于增加多种神经元的兴奋性,BDNF也促进突触形成、突触传递。长时程增强作用(long-term potentiation,LTP)是影响突触连接的重要因素,BDNF对此起关键作用。BDNF在体内首先被合成为前体物质(brain-derived neurotrophic factor precursor,proBDNF),后被细胞外纤溶酶和基质金属蛋白酶,或细胞内激素原转化酶和弗林蛋白酶裂解,释放出成熟的BDNF(mBDNF)和BDNF前肽段(pBDNF)。proBDNF是BDNF的前体蛋白,研究证明proBDNF与BDNF具有截然相反的作用。proBDNF与p75神经营养因子受体(p75 neurotrophin receptor,p75NTR)结合后抑制神经元生成、促进脑内Aβ沉积,进而引起小鼠学习与记忆缺陷。proBDNF可与p75NTR、sortilin受体复合物结合形成功能三聚体,抑制神经元的增殖、促进神经元凋亡。proBDNF对神经元的突触传递、突触可塑性具有负性调控作用,并且proBDNF可以抑制LTP,促进长时程抑制(LTD)。脑源性神经营养因子前肽(BDNF propeptide,pBDNF)是proBDNF前片段。pBDNF与BDNF、proBDNF一样,在兴奋性突触前的致密中心囊泡中储存与运输,离体海马神经元中发现,pBDNF也以诱导型方式分泌。研究表明,晚期胚胎与出生后早期小鼠体内pBDNF水平微乎其微,出生5 d后,小鼠脑内可以检测到pBDNF的存在。小鼠1月龄左右时,pBDNF水平急剧增加,在成年期(3~9月龄)pBDNF进入平台期不再产生明显变化。proBDNF在生长期脑内水平较高,成年期脑内则是mBDNF与pBDNF含量更加丰富,甚至在成年人脑内pBDNF水平是proBDNF的10余倍。既往认为pBDNF仅具有分子伴侣的功能,参与BDNF蛋白的正确折叠。最近研究表明,proBDNF裂解后产生的pBDNF本身有着重要作用:pBDNF能够在海马神经元表达并分泌;pBDNF通过激活caspase-3途径降低培养神经元突起密度并且p75NTR是pBDNF负调节的必要条件;pBDNF通过抑制GluN2B和AMPA促进海马LTD;Met66 pro-domain通过p75NTR/SorCS2抑制培养海马神经元生长锥。已知proBDNF与其受体p75NTR和sortilin共存于新生鼠小脑颗粒层,proBDNF可能通过同时与受体p75NTR、sortilin结合形成功能三聚体而介导小脑颗粒细胞迁移的抑制作用。而对于pBDNF的受体,目前说法不一。有研究表明,p75NTR虽不直接与pBDNF结合,但p75NTR是pBDNF起作用所必须的受体分子之一。但也有研究表示,并未检测到pBDNF与p75NTR和SorCS2的直接结合。因此,猜测p75NTR是介导pBDNF负性调控作用的重要前提条件,但并不是直接受体。阻断p75NTR,可能减轻pBDNF对海马神经元的毒性作用。因pBDNF对神经元的影响以及作用机制尚不明确。因此,本研究拟观察:1.pBDNF对原代培养神经元的神经毒性作用并探讨p75NTR在其中可能介导的作用;2.pBDNF对神经干细胞增殖的影响,并探讨其中可能的机制;3.pBDNF对转基因AD鼠学习记忆功能以及PSD-95蛋白的影响。2.材料与方法(1)CCK-8法检测海马神经元存活率采用怀孕16-18天的野生型C57BL/6J孕鼠,无菌条件下取出胎鼠,分离海马组织于96孔板中进行原代海马神经元培养。孔内加入不同浓度(0,10,50,100,200,300ng/ml)pBDNF重组蛋白进行干预,72h后CCK-8法检测450nm波长下光密度值(OD);然后观察在一定浓度的pBDNF(300ng/ml)下给予p75NTR抗体(140nM),72h后CCK-8法检测450nm波长下OD值。(2)免疫荧光染色和神经突起长度测定培养原代海马神经元,加入浓度为300ng/mL的pBDNF蛋白,72h后用免疫荧光法进行MAP-2染色,imageJ软件测量神经元突起长度变化;同时观察一起加入p75NTR抗体(140nM)后神经元突起长度变化。(3)TUNEL检测海马神经元凋亡培养原代海马神经元,加入浓度为300ng/mL的pBDNF蛋白,72h后使用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法(TUNEL)检测凋亡细胞;同时观察一起加入p75NTR抗体(140nM)后凋亡细胞百分比的变化。(4)EDU检测神经干细胞增殖培养海马神经干细胞,接种后加入浓度为300ng/mL的pBDNF蛋白,48h后加入EDU培养基培养,24h后采用EDU试剂盒进行检测;同时观察一起加入p75NTR抗体(140nM)后增殖细胞百分比的变化。(5)免疫印迹检测提取原代海马神经元各组细胞蛋白,检测p75NTR受体水平以及凋亡相关蛋白caspase-3、Bcl-2、Bax水平变化;提取海马神经干细胞各组细胞蛋白,检测增殖相关蛋白ERK 1/2与p-ERK 1/2水平变化;提取干预后AD鼠脑组织,检测PSD-95蛋白水平变化。(6)水迷宫实验将AD小鼠分为三组:AAV-GFP对照组、AAV-pBDNF实验组、AAV-pBDNF+p75NTR抗体组。所有小鼠于海马注射4周后进行Morris水迷宫实验来检测其学习记忆能力的变化。3.结果(1)pBDNF对海马原代神经元的存活率有抑制作用,在300ng/mL时pBDNF的抑制作用较为明显(P㩳0.05);当加入p75NTR抗体后,pBDNF的抑制作用明显减弱(P㩳0.05)。(2)pBDNF能够抑制原代海马神经元突起生长(P㩳0.05),而p75NTR抗体能够中和pBDNF的抑制作用(P㩳0.05)。(3)pBDNF组原代海马神经元的TUNEL阳性细胞明显增加,表示pBDNF组凋亡细胞百分比增加(P㩳0.05),当同时加入p75NTR抗体后,pBDNF的促凋亡作用减弱(P㩳0.05)。(4)pBDNF组海马神经干细胞的EDU阳性细胞明显减少,表示pBDNF组增殖细胞百分比减少(P㩳0.05),当同时加入p75NTR抗体后,pBDNF抑制增殖作用减弱(P㩳0.05)。(5)使用pBDNF蛋白处理培养的原代海马神经元其p75NTR受体蛋白浓度显著增加(P㩳0.05);原代海马神经元pBDNF组与对照组和p75NTR抗体拮抗组相比,其caspase-3、Bax含量增加,Bcl-2含量下降,差异具有统计学意义(P㩳0.05)。海马神经干细胞pBDNF组与对照组和p75NTR抗体拮抗组相比,p-ERK 1/2含量下降(P㩳0.05),而各组ERK 1/2含量无明显差异(P0.05)。(6)经过前5天的定位航行训练,第5天时对照组与AAV-pBDNF+p75NTR抗体组的逃避潜伏期均较第1天有明显下降(P0.05),而第5天pBDNF组AD鼠的逃避潜伏期虽然也较第一天有所缩短,但差异无统计学意义(P0.05)。在第6天检测期空间探索实验中,pBDNF组AD小鼠穿越平台次数较其余两组少(P0.05)。(7)实验结果表明,AAV-pBDNF组AD鼠海马内PSD-95含量较AAV-GFP组和AAV-pBDNF+p75NTR抗体组降低(P0.05),提示其神经突触后兴奋性传递水平降低,pBDNF可能通过降低海马内PSD-95的表达,进而降低AD鼠学习记忆功能。4.结论pBDNF不仅抑制原代海马神经元的活性,抑制其神经元突起生长,并且促进原代神经元凋亡,抑制海马神经干细胞增殖活动,表明pBDNF具有毒性作用,并且这种毒性作用可能是通过p75NTR受体介导产生。AAV-pBDNF能够抑制AD小鼠的学习记忆功能,降低海马内PSD-95的表达,说明pBDNF可能通过降低AD海马内PSD-95的表达而影响AD鼠学习记忆功能。
【学位授予单位】：中国人民解放军陆军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R749.16
【图文】：
陆军军医大学硕士学位论文均数 标准差的方式进行表示，两组之 test，多组之间比较使用 one-way ANOVA 或义。经元鉴定成功培养出原代海马神经元，神经元胞体显。
图 2. 小鼠新生原代培养细胞鉴定.2 Identification of primary hippocampal neurons. Immunofluorescence images res of hippocampal neurons. Scale bar = 50 μm..2 不同浓度梯度 pBDNF 对神经元活性的影响以及 p75NTR 抗体对影响图 3 所示，为了确定 pBDNF 对原代海马神经元存活的影响，我们分别用L、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、300 ng/mL)处理海现 pBDNF 对神经元存活的抑制作用呈浓度依赖性，结果显示 OD450在10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL 时，细胞活性无明显降低，差异无统.05）；当浓度为 200 ng/mL 时 OD450降低，与 0 ng/mL 处 OD450比较有统计学意义（P 㩳0.01）。当浓度为 300 ng/mL 时 OD450进一步降低学差异具有统计学意义（P 㩳0.01）。说明 pBDNF 对培养的原代海有抑制作用，且这种作用在 200 ng/mL 时影响显著，增加浓度会使这
. pBDNF 与 p75NTR 抗体对培养的原代海马神经元活性影响的 CCK-8 检测 pBDNF inhibits the viability of neurons depending on the p75NTR signaliraph shows different cell viabilities induced by different concentrations ofTR antibody (140 nM) together with pBDNF (300 ng/mL) for 72 h. (n=6 for , one-way ANOVA, **P<0.01 compared with 0 ng/mL pBDNF group,##P<0.0g/mL pBDNF group).3 pBDNF 对原代海马神经元突起长度的影响荧光结果显示，加入 pBDNF（300 ng/mL）后，培养的野生型小突起生长长度明显短于对照组（P＜0.01），而当 pBDNF 与 p75于新生海马神经元时，海马神经元受 pBDNF 的抑制作用有所减BDNF 组长，差异具有统计学意义（P ＜0.01）。说明 pBDNF 能经元的突起生长，并且 p75NTR 参与了这个作用。
【学位授予单位】：中国人民解放军陆军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R749.16
【图文】：
陆军军医大学硕士学位论文均数 标准差的方式进行表示，两组之 test，多组之间比较使用 one-way ANOVA 或义。经元鉴定成功培养出原代海马神经元，神经元胞体显。
图 2. 小鼠新生原代培养细胞鉴定.2 Identification of primary hippocampal neurons. Immunofluorescence images res of hippocampal neurons. Scale bar = 50 μm..2 不同浓度梯度 pBDNF 对神经元活性的影响以及 p75NTR 抗体对影响图 3 所示，为了确定 pBDNF 对原代海马神经元存活的影响，我们分别用L、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、300 ng/mL)处理海现 pBDNF 对神经元存活的抑制作用呈浓度依赖性，结果显示 OD450在10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL 时，细胞活性无明显降低，差异无统.05）；当浓度为 200 ng/mL 时 OD450降低，与 0 ng/mL 处 OD450比较有统计学意义（P 㩳0.01）。当浓度为 300 ng/mL 时 OD450进一步降低学差异具有统计学意义（P 㩳0.01）。说明 pBDNF 对培养的原代海有抑制作用，且这种作用在 200 ng/mL 时影响显著，增加浓度会使这
. pBDNF 与 p75NTR 抗体对培养的原代海马神经元活性影响的 CCK-8 检测 pBDNF inhibits the viability of neurons depending on the p75NTR signaliraph shows different cell viabilities induced by different concentrations ofTR antibody (140 nM) together with pBDNF (300 ng/mL) for 72 h. (n=6 for , one-way ANOVA, **P<0.01 compared with 0 ng/mL pBDNF group,##P<0.0g/mL pBDNF group).3 pBDNF 对原代海马神经元突起长度的影响荧光结果显示，加入 pBDNF（300 ng/mL）后，培养的野生型小突起生长长度明显短于对照组（P＜0.01），而当 pBDNF 与 p75于新生海马神经元时，海马神经元受 pBDNF 的抑制作用有所减BDNF 组长，差异具有统计学意义（P ＜0.01）。说明 pBDNF 能经元的突起生长，并且 p75NTR 参与了这个作用。
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