血浆同型半胱氨酸和MTHFR基因多态性与卒中后抑郁的相关性分析

发布时间：2020-08-22 16:26

【摘要】： 研究背景：卒中后抑郁是卒中发生后常见的并发症,1977年Folstein等首次报道抑郁是脑卒中后常见的伴随症状,称为卒中后抑郁(post-stroke depression, PSD)。一项多中心研究表明,脑卒中后的患者约有61%患有抑郁。目前对于PSD的定义还未明确,普遍认为PSD是指脑卒中后出现不同程度的抑郁症状并且症状持续2周以上。PSD的总体发病率为40%-50%,急性期的发病率约为33%,而康复期的发病率会稍升高,女性发病是男性发病的2倍,PSD的患者情绪低落,参加活动的兴趣减少,使康复时间延长,使服药依从性降低,给患者躯体及精神上带来沉重的负担,影响日常生活、学习和工作,增加家庭和社会的负担,这样又进一步会加重PSD的病情。脑卒中是急性脑血管病的总称,是一类疾病。根据第四次全国脑血管学术会议制定的脑卒中的诊断,脑卒中又分为出血性卒中和缺血性卒中,出血性卒中包括脑出血和蛛网膜下腔出血,缺血性卒中包括脑血栓形成、脑栓塞、腔隙性梗塞和短暂性脑缺血发作。脑卒中的发病率高、致残率高和死亡率高,随着诊疗技术的提高,脑卒中本身所致的危害性也随着下降,但是由脑卒中引起的并发症之一抑郁状态的危害性,越来越受到人们的关注。根据DSM-Ⅳ中抑郁的诊断,抑郁是指患者心境低落、与所处的境遇不相称,可以从闷闷不乐到悲痛欲绝,甚至发生木僵状态,严重者可出现妄想、幻觉等精神疾病症状,某些病例中焦虑与运动性激越比抑郁更为显著。抑郁的病因可概括为生物学因素和社会心理学因素,两者互相影响,其中生物学因素为主要因素。生物学因素包括三个方面：一为遗传易感性,即有抑郁家族史的人群患抑郁的几率是一般人群的2倍；二为神经递质的改变,存在两种学说：(1)单胺假说：此假说于60年代提出,认为抑郁是脑中单胺类神经递质[去甲肾上腺素(Norepinephrine,NE)和5-羟色胺(5-Hydroxytryptamine,5-HT)】功能不足引起；(2)受体假说：70年代以来人们对突触后受体敏感性的改变开始重视,提出抑郁症是脑中NE／5-HT的受体敏感性增高的缘故；三为神经内分泌研究,即抑郁病人下丘脑-垂体-肾上腺轴功能障碍,血浆皮质醇水平提高,尿皮质醇及代谢产物也高。 PSD的发病机制目前尚不明确。近年来学者们对PSD进行了一系列的研究,普遍认为是由社会心理学、神经解剖学和神经生物学等多方面因素介导的。目前研究较多的为以下三个方面：(1)卒中后抑郁与卒中的部位的相关性研究：Robinson等认为卒中的部位是卒中后抑郁发生的决定因素。研究发现左前半球和左前皮质下损害累及左额叶背外侧者更易发生PSD,病灶越接近额极,PSD发生率越高。NE和5-HT神经元胞体位于脑干,其轴突通过丘脑下部、基底神经节区,环绕胼胝体和放射冠,然后由前向后通过深层皮质,并逐渐发出分支,末端终止于表层,形成额叶／颞叶-基底节-脑干腹侧环路,该环路负责调控情绪、睡眠和认知等,当病灶累及以上环路时,引起NE和5-HT之间的平衡失调及其通路破坏从而导致抑郁。Frishkoff等研究发现,PSD患者左半球额部的N400效应早于其他部位出现,且持续时间长。但也有学者认为卒中后抑郁与卒中的病变部位无关。因此,有关卒中后抑郁与卒中病变部位的相关性目前仍未有一致的结论。(2)卒中后抑郁与神经递质的相关性研究：NE和5-HT是神经系统的重要递质,与人类的情感活动和精神活动紧密相关。NE和5-HT水平的下降会引起情绪低落等抑郁症状。卒中后引起NE和或5-HT神经元损伤,就会引起NE和5-HT的合成减少,或者引起突触后膜的5-HT受体数目和或敏感性改变都会导致抑郁.(3)卒中后抑郁与神经营养的相关性研究：脑源性神经营养因子是神经营养家族的主要成员,它参与了神经的再生、分化以及损伤后修复有关。近年来许多学者都研究了同型半胱氨酸不但和卒中有关,而且与抑郁呈正相关关系。Bottiglieri等发现50%的抑郁患者血中总Hcy水平高于其他人群对照组。Tolmunen等还发现抑郁的危险程度随着血中总Hcy水平的增高而增加。同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)是甲硫氨酸代谢过程中一个关键的中间代谢产物,有两条途径：最主要的途径是经过N5-甲基四氢叶酸在甲硫氨酸合成酶(Methionine Synthase,MS或者MTR)作用下提供甲基转变甲硫氨酸,此途径需要叶酸和维生素B12辅助,N5-CH3-FH4是四氢叶酸经N5,N10-亚甲基四氢叶酸还原酶(N5, N10-methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)催化5,10-亚甲基四氢叶酸而产生；另一条途径是通过胱硫醚缩合酶(Cystathionine (?)-Synthase,CBS)催化与丝氨酸缩合成胱硫醚,后者进一步生成半胱氨酸和酮丁酸。 Hcy引起抑郁的机制可能涉及以下三个方面：(1)Hcy升高会影响单胺递质的甲基化过程。(2)Hcy导致的钠、钾2ATP酶的抑制可能与抑郁有关。(3)Hcy及其代谢产物可作为离子通道和几种代谢型谷氨酸受体激动剂而产生神经毒性作用。NE或5-HT是导致抑郁症发生的重要神经递质。血浆Hcy水平升高提示体内最重要的甲基直接供给体S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)的生成减少。使得甲基化代谢无法正常进行,其中影响之一就是NE无法甲基化生成肾上腺素,引起NE在神经末梢堆积。当神经末梢胞浆中游离的NE浓度过高时,会反馈抑制囊泡中NE的生物合成,当冲动到达神经末梢时,NE释放到突触间隙减少,功能降低,从而引起抑郁的产生。有研究已发现同型半胱氨酸作用于神经递质的机制是通过抑制儿茶酚胺和SAM中催化甲基化反应的酶类。 Reynols等在70年代第一次提出同型半胱氨酸-甲基供体途径与抑郁之间的关系。Bryen等已经证明了Hcy与神经递质有关。Hcy与神经递质相关的实验中,最直接证明的研究是发现抑郁患者若血中Hcy水平高则脑脊液中的SAM、5-HT和NE等神经递质会降低,间接的研究表明SAM可以作为抗抑郁药物,且效果要优于安慰剂和三环类抗抑郁药。在Hcy甲基化过程中有一些限速酶如MTHFR、CBS和MTR,其中MTHFR是同型半胱氨酸代谢中最关键的酶。人类MTHFR基因定位于常染色体1p36.3上,包括11个外显子和10个内含子,cDNA全长212 kb。MTHFR基因至少有7个位点发生C→T碱基变异,分别位于559,677,692,764,985,1 015和1081处,目前研究认为位于第4外显子的C677T碱基突变最为常见。C677T(丙氨酸→缬氨酸)碱基变异可产生HinfI限制性酶切位点,使MTHFR热敏感性改变而致酶活性改变,突变纯合子酶活性只有正常的30%,杂合子酶活性为正常的65%。许多研究认为MTHFR基因的677C→T的突变引起了MTHFR活性的降低,从而升高了血中Hcy的水平。Osvaldo等研究发现携带MTHFR C677T的TT基因型的参与者要比携带CC基因型的参与者血中Hcy要高0.19mg／L。对挪威老年人群进行研究中发现携带TT基因型的MTHFR基因与抑郁有关,而不携带TT基因型的与抑郁无关。在另外一些研究中还发现MTHFR基因的677C→T的突变与抑郁呈正相关关系。目的：本实验目的在于探讨高Hcy与PSD的对应关系,MTHFR基因多态性在卒中后抑郁中的作用,探讨MTHFR基因多态性与PSD的关系。研究方法及分组：以珠江医院神经内科住院病人为研究人群,患者根据第四次全国脑血管学术会议做出卒中诊断和汉密尔顿抑郁量表做出抑郁诊断,按入组条件选择入组病人例,分为卒中组50例(男32例,女18例)和卒中后抑郁组59例(男38例,女21例)。采用荧光偏振免疫法检测血浆Hcy浓度。运用聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性分析技术(Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP),采集被试者全血2mL,EDTA抗凝后采用苯酚-氯仿抽提法提取外周血白细胞和基因组DNA。利用PCR-RFLP应用引物(上游5'-T GA A GG A GA A GGT GT CT G CGG GA-3',下游为：5'-A GG A CGGT G CGG T GA GA G T G-3')扩增MTHFR基因,用Hinf I内切酶检测MTHFR基因677C→T的多态性。比较基因频率和基因型。运用SPSS13.0统计软件包,采用卡方检验比较卒中组与卒中后抑郁组各等位基因,基因型频率分布的差异。结果：卒中后抑郁组血浆Hcy水平明显高于卒中组,差异有统计学意义(t=-12.840,P=0.000)。卒中后抑郁组血浆高Hcy发生率较卒中组高,差异有统计学意义(t=-17.958,P=0.000)。进一步分层分析,卒中组内男性和女性Hcy浓度差异无统计学意义(t=-0.716,P=0.477),说明卒中组内男女性别不影响Hcy浓度的变化。卒中后抑郁组内男性和女性Hcy浓度差异无统计学意义(t=-0.657,P=0.516),说明卒中后抑郁组内男女性别不影响Hcy浓度的变化。对于CC基因型的Hcy浓度,卒中组高于卒中后抑郁组,差异有统计学意义(t=-3.192,P=0.004)；对于CT基因型的Hcy浓度,卒中后抑郁组高于卒中组,差异有统计学意义(t=-3.782,P=0.001)；对于TT基因型的Hcy浓度,卒中后抑郁组高于卒中组,差异有统计学意义(t=-3.746,P=0.001)。经卡方吻合度检验,卒中后抑郁组和对照组基因型分布均符合Hardy-weinberg平衡定律(P0.05),所选样本具有群体代表性。卒中组与卒中后抑郁组基因型分布的差异有统计学意义(x2=10.312,P=0.006),卒中后抑郁组TT型频率高于卒中组；卒中组和卒中后抑郁组基因型分布存在差异。卒中组与卒中后抑郁组等位基因频率的差异亦有统计学意义(x2=11.065,P=0.001),卒中后抑郁组T等位基因频率高于卒中组。卒中组与卒中后抑郁组在等位基因频率上确实存在差异,OR为2.510,95%CI为1.452-4.338,为携带T基因是发生卒中后抑郁的危险因素。结论： 1.卒中后抑郁患者血浆Hcy浓度水平升高且血浆高Hcy发生率高于卒中患者。提示血浆Hcy浓度升高可能是卒中后抑郁的一个危险因素。 2.携带TT基因型和T等位基因对Hcy浓度的影响最大。本研究发现性别和年龄对Hcy浓度的影响不明显。 3.MTHFR基因C677T突变纯合子(TT型)可能是卒中后抑郁的危险因素,可能是通过影响血浆Hcy的水平而参与卒中后抑郁的发病及临床表现,但具体机制还不清楚。有待于开展深入研究证实。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R749.1
【图文】：

序列,产物,碱基突变,内切酶

酶切反应:从扩增产物中各取20ul，分别加入2.sul限制性内切酶 Hinf137oc水浴3h。最后分别以3%的琼脂糖凝胶(已加入EB)电泳，电压为SV/cm，lxTBE，45分钟后凝胶成像系统下鉴定其基因型并摄像。如图2: M1234567图2为MTHFR基因PCR一盯LP产物结果2，7为野生纯合型CC型，l，5，6为突变杂合型CT型，3，4为突变纯合型TT型结果判断:MTllFR基因第4位外显子发生C*T碱基突变时，该段序列产生一个内切酶Hifl的限制性酶切位点。上下游引物所特异扩增的片段长度为198bp

基因型,浓度差,统计学意义,诊断图

TT型的Hcy浓度差异有统计学意义 (F=5.143，P=0.009)，卒中后抑郁组的CC型、CT型和TT型Hcy浓度差异有统计学意义(F一 12.293，p一0.000)。如表7和图3:表7卒中组和卒中后抑郁组与对照组Hcy浓度的比较(umol/L)组别基因型HcCT型F值P值卒中组卒中后抑郁组CC型 11.30士3.46 8.30士1.8613.58士2.7819.23士6.70丫浓度TT型14.41士1.6722.90士9.28 5.14312.293 0.009 0.000t值 3.192一3782一3746P值 0.004 0.001 0.00125.00丛因型.CC型.CT型口TT型2000不:型肤氨酸半同二卒中组卒中后抑郁组诊断图3两组间各基因型同型半肤氨酸的比较

【参考文献】