磷酸化SET对细胞凋亡的影响及其机制的研究

发布时间：2020-09-30 12:07

　　 背景:神经元大量丢失是阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)中的一个重要病理变化,而凋亡是神经元死亡的主要形式。SET是PP2A的内源性抑制剂,广泛分布于大脑的各个区域,并主要定位于细胞核内。在AD脑中,SET的表达水平显著增加,导致PP2A活性下降,引起tau的异常过度磷酸化,是AD发病的关键因素。有研究表明,SET与神经元的凋亡相关,并且SET对细胞凋亡的影响与其在胞浆中的水平相关。AD脑中SET的定位也发生改变,由胞核转移至胞浆,我们前期研究中通过对SET核定位信号序列的研究发现SET Ser-9位点发生磷酸化会导致SET的核定位信号失活,引起SET滞留于胞浆中,而用Ser-9位点特异性的磷酸化抗体检测也确定了AD脑中SET在该位点的磷酸化水平显著增加。SET作为PP2A的特异、高效的内源性抑制剂,通过抑制PP2A的去磷酸化作用,参与了细胞内许多分子活性的调节,包括与细胞生存相关的p53,Akt等激酶活性的调节。NM23-H1是一个代谢抑制因子,它具有DNA酶活性,能够剪切DNA造成DNA损伤,引起凋亡,同时它也是p53的正调节因子,能够通过上调p53活性促进凋亡的发生。正常情况下,SET能够与NM23-H1组成复合物,在应激条件下,NM23-H1与SET发生解离,游离的NM23-H1就会入核,剪切DNA引起细胞凋亡。有研究表明Tau蛋白尤其是非磷酸化的tau能够与DNA结合,具有保护DNA双链的完整性的作用,而SET介导的tau蛋白异常过度磷酸化是否影响tau对DNA的保护作用仍不清楚。这些研究提示,磷酸化的SET可能参与神经元凋亡的过程,但具体机制不明。本研究中,我们发现过表达磷酸化的SET会导致SET滞留于胞浆中,导致神经元的凋亡。通过在HEK293/tau细胞中的研究发现,磷酸化的SET对PP2A的抑制作用比野生型SET更加显著,引起p53的过度磷酸化,导致P53的过度激活,进一步引起Bax/Bcl-2的比值升高,激活caspase 3。而磷酸化的SET并没有引起Akt的活性增加。另外,磷酸化的SET还导致了NM23-H1从SET/NM23-H1复合体中被释放,使其从胞浆转移到胞核,一方面作为P53的正调因子进一步激活p53,一方面直接发挥其DNA酶活性,引起DNA损伤。同时,磷酸化的SET还引起了胞核中总tau和非磷酸化的tau的减少,使其对DNA的保护作用发生障碍。本研究证实,磷酸化的SET通过介导P53的过度活化及NM23-H1入核和核tau减少引起的DNA损伤引起细胞凋亡的发生。这些发现表明,磷酸化的SET参与了AD中神经元的凋亡发生,并探讨了其引起细胞凋亡的新机制,为AD治疗靶点的选择提供一个新思路。目的:明确磷酸化SET对神经元凋亡的影响,探讨其引起细胞凋亡的潜在分子机制,为AD药物的开发提供新思路。方法:利用基因定点突变将SET的第9位丝氨酸位点(Ser-9)突变为丙氨酸(模拟非磷酸化SET)和谷氨酸(模拟磷酸化SET),并构建基因的质粒表达载体以及腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)载体。体外培养大鼠原代皮质神经元和稳定转染人最长tau(tau441)基因的人胚肾细胞,即HEK293/tau细胞,并在其中过表达SET野生型及其突变体,利用流式细胞术及TUNEL(Td T介导的d UTP缺口末端标记技术)法检测神经元及HEK293/tau细胞的凋亡情况。在HEK293/tau细胞中,利用激光共聚焦技术检测转染后SET的亚细胞定位和caspase-3激活情况,利用PP2A活性检测试剂盒检测PP2A的活性及western blotting检测Y307位点磷酸化的PP2A(PP2A的非活性状态)水平明确磷酸化SET对PP2A活性的影响。利用激光共聚焦和免疫共沉淀的方法检测了磷酸化SET与PP2A的催化亚单位PP2Ac的结合情况,探讨磷酸化SET对PP2A活性影响的机制。通过免疫荧光观察了转染磷酸化SET后细胞凋亡执行相关蛋白caspase 3的活化形式——剪切的caspase 3(cleaved caspase 3)的水平及细胞核的形态变化,利用western blotting检测了cleaved caspase 3的水平,相关激酶p53的磷酸化及其下游Bax,Bcl-2的水平,Akt及其下游GSK-3β的磷酸化水平。同时,为了检测过表达磷酸化SET对SET与NM23-H1结合及NM23-H1的核浆分布的影响,采用免疫共沉淀方法检测NM23-H1与SET的结合,分离胞浆胞核蛋白,通过western blotting检测胞浆胞核中NM23-H1的水平变化,及转染后胞浆胞核中总tau及非磷酸化tau的变化,同时通过用彗星实验(comet assay)检测DNA的损伤情况。结果:在大鼠原代皮质神经元及HEK293/tau细胞株中,分别过表达SET及其突变体后,发现磷酸化的SET引起了神经元和HEK293/tau细胞的凋亡和DNA断裂。在HEK293/tau细胞中,磷酸化的SET在胞浆中聚集,引起了caspase 3活化增加,细胞核固缩。检测PP2A活性发现,过表达磷酸化的SET后,PP2A的活性比野生型进一步下降,其活性抑制相关位点Y307的磷酸化增加,进一步研究发现过表达磷酸化SET后,其定位于胞浆中,与PP2A的催化亚单位PP2Ac共定位增加,免疫共沉淀也证实磷酸化的SET与PP2Ac的结合较野生型SET增加。western blotting发现野生型的SET及磷酸化SET都能使p53这一促凋亡因子的活性形式丝氨酸Ser-46位磷酸化的p53水平增加,而磷酸化SET引起的p53磷酸化水平增加较野生型SET更为显著,并且p53下游介导凋亡的分子Bax及Bcl-2的比值也增加,而对另一促进细胞生存的激酶Akt的活化形式-丝氨酸Ser-473位点磷酸化的Akt水平及其下游GSK3β的磷酸化水平的检测发现野生型SET可以明显增加Akt的活性,而磷酸化的SET对Akt的活性无显著影响。免疫沉淀和western blotting发现过表达磷酸化SET后NM23-H1与SET结合减少,且NM23-H1在胞浆中的分布减少,在核内分布增加,检测总tau和非磷酸化tau的分布也发现核内的总tau和非磷酸化tau均减少,同时彗星实验也发现过表达磷酸化SET后DNA碎片化增加。结论:磷酸化的SET可以引起原代神经元及HEK293/tau细胞发生凋亡,磷酸化SET一方面通过增强对PP2A活性的抑制,使p53的46位丝氨酸(Ser-46)磷酸化增加的而过度活化,促进p53的促凋亡作用,引起Bax/Bcl-2比值增加,caspase 3活化增加,另一方面通过释放NM23-H1入核剪切DNA及破坏tau对DNA的保护作用进一步促进凋亡发生。
【学位单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R749.16
【部分图文】：

华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文细胞色素 c 的释放，激活 caspase-9 然后进一步激活 caspase-3，最终导致细胞死亡[116-18]。相反的，内部凋亡途径（线粒体途径），是由发育信号或细胞毒素刺激激活独立于 caspase-8 和 Fas 相关死亡域蛋白（FADD）。线粒体的完整性能够维持促凋和抗凋亡（Bcl-2 家族成员）分子之间的平衡[6]。内部途径同样也会刺激释放细胞素-C，然后与外部途径重合，最终激活 caspase-3[13, 16, 19]。

68.Aβ 神经毒性在阿尔茨海默病中的细胞路径[75]。Aβ 与几种不同的神经元细体相互作用，并激活小胶质细胞，触发信号转导级联导致半胱天冬酶激活，成和 Ca2 +内流。 细胞内 Ca2 +浓度增加可能激活 calpain，反过来激活半胱天u 蛋白激酶 Cdk5，导致神经原纤维缠结、凋亡和神经退行性变。道发现氧化应激及热应激时，核 tau 水平水增加，保护细胞不发生凋亡，但时，即使没有外界应激的情况下，细胞仍然发生凋亡，提示 tau 对 DNA 的亡中的重要作用[84]。

图 3. 核 tau 对基因的保护作用[85]。3、早老蛋白早老蛋白 1 和早老蛋白 2 突变是早发型家族性阿尔茨海默病的主要原因[86]。老素是 Aβ 产生所必须的，其突变增加 Aβ42 产生，早老素突变可能增加神经元对亡的易感性[87, 88]。4、载脂蛋白 Eε4 等位基因的遗传是 60 岁以后阿尔茨海默病最常见的已知遗传风险因素[89]。等位基因促进 Aβ 聚合成斑块，可能会损害神经元再生或促进氧化应激[89, 90]。但些机制是否参与阿尔茨海默病中神经元细胞死亡仍不能确定。四、阿尔茨海默病中凋亡机制研究的展望

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