敲除小鼠神经系统Cul4b基因导致GFAP阳性细胞增多

发布时间：2020-10-17 06:56

　　 CUL4B属于Cullin家族,该家族成员参与构成Cullin-Ring泛素连接酶(CRLs)复合物,该复合物是目前已知最大的一类泛素连接酶。CUL4B参与构成的CRL复合物(CRL4B)可识别并特异性结合多种底物蛋白,引起底物蛋白的降解,进而调节多种生理或发育过程。本实验室近期研究表明,CRL4B复合物可介导H2AK119单泛素化(H2AK119ub1),并通过与PRC2复合物协同作用促进H3K27三甲基化(H3K27me3),进而导致靶基因的转录抑制。人类CUL4B基因突变可导致X连锁精神发育迟滞综合征(XLMR),患者还伴有身材矮小、步态异常、失语等症状。与人类不同,全身性敲除Cul4b基因导致小鼠胚胎致死。然而,仅敲除胚体而非胚外组织Cul4b (Cul4bSox2-Cre)的小鼠可以存活,并表现出空间学习障碍,与患者精神发育迟滞的表型一致。本论文主要分析了CUL4B在大脑发育过程中发挥抑制神经前体细胞(NPCs)向GFAP阳性细胞分化的作用及其机制。首先利用体外培养体系,我们发现缺失Cul4b导致神经前体细胞向GFAP阳性及S100β阳性星形胶质细胞分化增多。在神经系统特异性Cul4b基因敲除小鼠的大脑中也发现GFAP阳性细胞增多。机制分析发现,Cul4b缺失所引起神经前体细胞向GFAP阳性细胞分化增多是由前列腺素D2合成酶PTGDS表达上调所致。增加的GFAP阳性细胞分化可通过PTGDS抑制剂或者敲低Ptgds而得到拯救。更重要的是,加入外源性PTGDS可使野生型神经前体细胞向GFAP阳性细胞分化增多。我们进一步发现Ptgds基因转录可被CUL4B/PRC2复合物抑制。总之,我们的结果证实CUL4B在神经发育过程中对GFAP阳性细胞分化起负调控作用。本课题主要分为以下两个部分：第一部分小鼠神经系统Cul4b缺失导致GFAP阳性细胞增多为探究CUL4B是否调节神经前体细胞分化,我们将Cul4b-floxed小鼠与Nestin-Cre转基因小鼠交配,得到神经系统特异性Cul4b基因敲除小鼠(Cul4bNestin-Cre),并从胚胎发育第15.5天的Cul4bNestin-Cre胎鼠以及同窝对照胎鼠的前脑中分离神经前体细胞进行体外培养。增殖及凋亡实验显示Cul4b缺失的神经前体细胞与野生型并无差别,提示CUL4B不影响神经前体细胞的增殖。随后撤去生长因子4-8天以诱导神经前体细胞分化。与野生型神经前体细胞相比,Cul4b缺失的神经前体细胞向GFAP阳性细胞分化增多。用抗S100p抗体分析也得到相同的结果。另一方面,与野生型神经前体细胞相比,Cul4b缺失的神经前体细胞向神经元(TUJ1阳性细胞)分化减少。随后,我们在体内验证了Cul4b对GFAP阳性细胞的作用。与体外实验结果一致,GFAP阳性细胞在Cul4bNestin-Cre小鼠的多个脑区都明显多于同窝对照小组,包括皮层、海马、丘脑、下丘脑、纹状体等。第二部分CUL4B调控GFAP阳性细胞分化是通过PTGDS介导的JAK-STAT通路调节GFAP基因的表达以及神经前体细胞的神经元-星形胶质细胞命运转化。因此,我们研究了CUL4B在神经前体细胞分化中的作用是否也是通过JAK-STAT通路。与野生型细胞相比,Cul4b缺失的神经前体细胞分化过程中,磷酸化的Stat3(Y705位,Stat3的活化形式)的水平明显升高。Cul4bNeslin-Cre小鼠的皮层和海马区的p-STAT3水平也明显高于同窝对照小鼠。此外,抑制p-STAT3可拯救Cul4b缺失的神经前体细胞向星形胶质细胞分化增多的表型。以上结果提示Cul4b缺失的神经前体细胞向星形胶质细胞分化增多依赖于JAK-STAT通路的激活。我们近期的研究表明,CRL4B复合物可以单泛素化H2AK119 (H2AK119ub1),并协同PRC2复合物转录抑制多种靶基因。与同窝对照小鼠相比,Cul4bNestin-Cre小鼠皮层中H3K27me3水平明显降低。接下来,我们进行了芯片分析,检测Cul4bNestin-1re小鼠大脑中哪些基因的表达发生改变,结果发现Ptgds在Cul4bNestin-Cre小鼠大脑中的表达明显高于同窝对照小鼠。随后我们用实时定量PCR.Wester1 blotting以及免疫染色等实验证实,敲除Cul4b后PTGDS的表达明显升高。PTGDS在Cul4b缺失的大脑及神经前体细胞中表达升高,因此我们研究PTGDS是否介导了GFAP阳性细胞分化增多。用PTGDS的活性抑制剂AT56处理神经前体细胞可以有效拯救GFAP阳性细胞分化增多的表型。此外,在Cul4b缺失的神经前体细胞中通过感染含有shRNA的病毒来敲低PTGDS的表达也可拯救GFAP阳性细胞分化增多的表型。加入外源性PTGDS蛋白可显著增加野生型神经前体细胞向GFAP阳性细胞分化的比例。总之,以上结果提示CUL4B缺失导致GFAP阳性细胞分化增多是由PTGDS介导的。接下来我们通过染色质免疫沉淀实验检测Ptgds基因是否可被CRL4B复合物抑制。与预期一致,ChIP实验显示CUL4B可直接结合至P1gds启动子上。野生型小鼠大脑细胞中CUL4B.EZH2及H3K27me3均可在P1gds启动子上聚集,而缺失CUL4B后EZH2不能与Ptgds启动子结合,提示大脑中PRC2复合物结合至ptgds依赖于CRL4B复合物。ChIP结果同时证实,与对照细胞相比,Cul4b缺失的神经前体细胞中Ptgds启动子区域H3K27me3结合减少,H3K4me3结合增多。总之,以上结果证实CRL4B/PRC2复合物可通过促进H2AK119单泛素化和H3K27三甲基化来抑制Ptgds转录。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：R749.93
【部分图文】：

胚胎发育第１５．５天的扣饼严＂＇＂－ｅｖｅ胎鼠Ｗ及同窝对照胎鼠中分离神经前体细胞进??行体外培养。ＣＵＬ４Ｂ免疫巧光分析显示，ＣＵＬ４Ｂ在对照小鼠的神经前体细胞中??高表达，而在ＣｗＷ严＂＂－ｎ＇ｅ小鼠的神经前体细胞中不表达（图１－１），说明敲除效??果良好。??Ｃｏｎｔｒｏｌ?Ｃｕ／４ｄ－ｎｕｌｌ??■■??图１－１?小鼠及对照小鼠的神经前体细胞的ＣＵＬ４Ｂ免疫焚光分析。??Ｆｉｇｕｒｅ?１－１?Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ?ｏｆ?ＣＵＬ４Ｂ?ｉｎ?ＮＰＣｓ?ｏｆ?Ｃｍ／４６胞＂＂－Ｃｒｅ?ａｎｄ?ｃｏｎｔｒｏｌ??ｍｉｃｅ．??首先，我们检测了敲除Ｃｕ／伯对神经前体细胞的増殖和调ｔ的影响。Ｋｉ６７??免疫黃光分析结果显示，Ｃｕ／飾敲除和对照神经前体细胞中Ｋｉ６７阳性细胞比例??并无明显差异（图１－２Ａ），提示ＣＵＬ４Ｂ缺失并未影响神经前体细胞增殖。细胞??生长曲线证实始敲除和对照神经前体细胞的生长速度没有明显差异（图??１－巧）。??２８??

体细胞均可被诱导分化为神经元和星形胶质细胞。然而，ＧＦＡＰ免疫巧光实验??分析结果显示，与对照神经前体细胞相比，Ｃｍ／姑敲除的神经前体细胞向ＧＦＡＰ??阳性的星形胶质细胞分化的比例有明显升高（图１－４Ａ，ｐＯ．ＯＯｌ）。Ｓｌｏｏｐ?（另一??种星形胶质细胞的标记物）免疫焚光实验分析结果也显示，与对照神经前体细胞??相比，ＣＷ如敲除的神经前体细胞向Ｓｌｏｏｐ阳性的星形胶质细胞分化的比例有明??显升高（图?１－４Ｂ，ｐＯ．Ｏｌ）。??Ａ??Ｃｏｎｔｒｏｌ?ＣｕＭｂ＂曲－扣??麵？？Ｕｐ?ｉ??Ｃｏｎｔｒｏｌ??■ｍｉ?ｎ?Ｉ??０?Ｃｏｎｔｒｏｌ??图１－４?敲除和对照神经前体细胞向星形胶质细胞的分化情况。??（Ａ）?ＧＦＡＰ免疫巧光实验；（Ｂ）?Ｓｌｏｏｐ免疫巧光实验。??Ｆｉｇｕｒｅ?１－４?ＣＷ如－ｎｕｌｌ?ａｎｄ?ｃｏｎｔｒｏｌ?ＮＰＣｓ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔ：ｅ?ｉＭｏ?ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ．??（Ａ）?Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ?ｏｆ?ＧＦＡＰ；?（Ｂ）?１１１１１１１１１１１〇１１＂〇化８６６１１〇６?ｏｆ?Ｓｌｏｏｐ．??为检测敲除对神经前体细胞向神经元分化的影响，我们进行了?ＴＵＪｌ??免疫巧光实验。结果显示，与对照神经前体细胞相比，靴敲除的神经前体细??胞向神经元（ＴＵＪ１阳性细胞）分化的比例明显降低（图１－５

?ＣｕＭｂ，、．’ｅ如林?Ｗ??结豁嘶冻糸氣??户令々？片、＊?Ｖ气处夺＊；；?Ｓ??Ｖ、令＇公：巧＼、Ｖ、？媒??图１－８?小鼠脑中的ＧＦＡＰ阳性细胞的细胞形态并无明显改变。??Ｆｉｇｕｒｅ?１－８?Ｔｈｅ?ＧＦＡＰ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ?ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ?过ｉｄ?ｎｏｔ?ｓｈｏｗ?ｒｅｍａｒｋａｂｌｅ??ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ?ｃｈａｎｇｅ?ｉｎ?Ｃｗ／４々ａ化＂＂－Ｇｇ?ｍｉｃｅ．??随后我们通过免疫姐化实验分析了打似６Ｗａ＂＂－〇ｅ及同窝对照小鼠前脑组织中??Ｓｌｏｏｐ阳性细胞的数量。结果显示，与野生型对照小鼠相比，仿／如Ｗｕ＂＂－ＣＶｅ小鼠??的皮层及海马区域中Ｓｌｏｏｐ阳性细胞数量并无明显改变（图１－９）。??誦圓??图＾９?Ｃ？／媒Ｗ６Ｗ＂－〇ｅ小鼠及同窝对照小鼠的前脑组织中Ｓｌｏｏｐ免疫沮织化学染色。??扔ｇｕｒｅ?１－９?Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ?ｏｆ?Ｓｌｏｏｐ?ｉｎ?化ｅ?ｆｏｒｅｂｒａｉｎｓ?ｏｆ?ａｎｄ??Ｉｈｔｅｒｍａｔｅ?ｃｏｎｔｒｏｌ?ｍｉｃｅ．??接下来我们分析了?ａ＜／飾敲除小鼠脑中神经元的数量，对小鼠的皮层和海马?．??３３??
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本文编号：2844452