精神分裂症外周血miRNA-1908-5p表达分析及其靶基因与精神分裂症的关联研究

发布时间：2020-10-18 04:35

　　 精神分裂症是一种严重多基因遗传的精神障碍,伴有行为、情感以及思维异常,位列我国精神疾病负担第一位。精神分裂症的发病机制尚未被明确阐释,尽管全面的全基因组关联研究揭示了许多与精神分裂症易感性相关的常见遗传变异,但精神分裂症的病因仍然模糊不清,因此有必要进行进一步的研究以探索更多未发现的遗传变异。在精神分裂症的基因研究领域,microRNA(miRNA)已经受到了越来越多的关注。许多研究认为miRNA不仅在人类大脑的发展中起重要作用,而且影响大脑疾病的发生。有证据表明健康个体和精神分裂症患者之间miRNA的表达情况显著不同。miRNA靶向调节多个基因的表达,具有阐明精神疾病复杂的病理过程的潜力。目的:分析和比较精神分裂症患者和健康对照者外周血中miRNA的表达,并预测表达水平显著不同的miRNA所调控的靶基因;探索靶基因非编码区和功能区单核苷酸多态性与精神分裂症的关联性,为精神分裂症的病因研究提供依据。方法:本研究第一部分采用病例-对照研究设计,选择15例首发精神分裂症患者和15例与病例性别、年龄1:1匹配的健康对照作为研究对象,采集外周全血提取RNA,应用转录组二代测序法检测病例组和对照组外周血中miRNA和mRNA的表达情况,选择表达差异显著的miRNA,通过实时荧光定量PCR法进一步验证它们的表达情况,最后在靶基因预测数据库中预测miRNA调控的靶基因。本研究第二部分依旧采用病例-对照研究设计,纳入761例精神分裂症患者和775例健康对照作为研究对象,采集外周血提取DNA,应用飞行质谱法检测由第一部分研究所得的靶基因的基因型,探讨这些基因上非编码区和功能区单核苷酸多态性与精神分裂症的关联性。卡方检验用于分析病例组和对照组间各个基因的等位基因、基因型以及单倍型的分布情况,Logistic回归用于分析各种等位基因、基因型及单倍型与精神分裂症的关联性。使用的统计软件包括SPSS24.0、Haploview4.2、SNPStats在线软件和Graphpad Prims 5.0。结果:1.本研究转录组二代测序部分共纳入30例研究对象(15例病例vs 15例对照),平均年龄为25.6±5.42岁。miRNA分析结果显示,共有138种miRNA在精神分裂症患者和健康对照中表达存在差异,其中87种在精神分裂症患者中过表达,51种低表达。在差异表达的miRNA中,结合表示差异显著程度的Fold change值、Padj值和表示表达量的readcount值筛选出6个miRNAs:has-miR-328-3p、has-miR-92b-3p、has-miR-1908-5p、has-miR-4467、has-miR-6786-3p和has-miR-30e。结合文献报道进一步选定has-miR-1908-5p和has-miR-30e进行实时荧光定量PCR,验证这两个miRNA的表达情况。实时荧光定量PCR结果显示,以P=0.1作为检验水准,has-miR-1908-5p在精神分裂症患者外周血中表达水平高于健康对照(P=0.085),而miR-30e表达情况无统计学差异,因此has-miR-1908-5p被选为本研究第二阶段的miRNA。2.通过在三个数据库(TargetScan7.2、miRDB、DIANA microT-V5.0)中预测has-miR-1908-5p的靶基因,三个数据库中共同包含的靶基因有30个。结合转录组二代测序结果mRNA的表达情况,这30个靶基因中有6个基因的mRNA在精神分裂症患者中表达显著下调,与调控它们的靶基因miRNA-1908-5p表达上调符合调控关系。进一步结合文献报道,本研究最终选定CACNA2D2、CMIP、DBN1和ZNF385A四个靶基因作为进一步探索单核苷酸多态性与精神分裂症关联性的目的基因。3.通过NCBI-SNP、Ensembl和1000 Genomes数据库在4个靶基因的非编码区和功能区选择位点,最终确定15个位点进行单核苷酸多态性分析,分别为CACNA2D2(rs35908181、rs45536634、rs59336240、rs12496815、rs3806706),CMIP(rs12925980、rs3751859、rs2287112、rs7193107、rs77700579),DBN1(rs2544809、rs2545794)和ZNF385A(rs2700159、rs2887875、rs2706252)。4.CACNA2D2基因上5个位点rs35908181、rs59336240、rs45536634、rs3806706和rs12496815的检出率分别为97%、93%、97%、98%和92%。Hardy-Winberg平衡(HWE)检验结果提示rs59336240和rs35908181位点在对照组中不符合HWE(P0.05),其余3个位点符合HWE。对符合HWE定律的3个位点进行关联分析,结果表明在精神分裂症患者和健康对照组之间:(1)rs45536634位点A,G等位基因频数分布存在统计学差异(χ~2=4.002,P=0.045),携带A型等位基因罹患精神分裂症的风险是携带G型等位基因的1.304倍(OR=1.304,95%CI=1.005-1.691);依据赤道准则,超显性遗传模型为该位点的最优遗传模型(AIC=2060.3),在这种遗传模型下,携带GG+AA基因型的人群患精神分裂症的风险要低于携带GA基因型的人群(OR=0.698,95%CI=0.523-0.931)。(2)rs3806706位点的等位基因频数分布差异无统计学意义(χ~2=1.436,P=0.231);超显性遗传模型为该位点的最佳遗传模型(AIC=2091.8),在此遗传模型下,基因型频数的分布存在统计学差异(χ~2=4.715,P=0.03),携带GC基因型的人群患精神分裂症的风险高于携带GG+CC基因型的人群(OR=1.255,95%CI=1.022-1.538)。(3)rs12496815位点等位基因频数分布的差异在统计学上无显著意义(χ~2=0.354,P=0.552);该位点的最优遗传模型为显性和超显性,二者的AIC均为1945.1,在这两种遗传模型下,基因型频数分布无统计学差异(显性遗传模型下χ~2=0.016,P=0.9;超显性遗传模型下χ~2=1.142,P=0.285)。(4)分别对CACNA2D2基因上相邻2个位点组成的单倍型以及3个SNP位点组成的不同单倍型进行分析,结果显示这些单倍型在病例组和对照组中的分布无统计学差异。5.CMIP基因上5个位点rs2287112、rs7193107、rs77700579、rs12925980、rs3751859的检出率依次为96%、96%、98%、98%和98%。各位点在对照组中均符合HWE(P0.05)。分别对这5个位点进行关联分析,结果显示在精神分裂症患者和健康对照组之间:(1)rs2287112位点的等位基因频数分布无统计学差异(χ~2=0.914,P=0.3339);隐形遗传模型为该位点的最优遗传模型(AIC=2045.9),在隐性遗传模型下,该位点的基因型频数分布差异有统计学意义(χ~2=5.754,P=0.016),携带GG基因型的人群罹患精神分裂症的风险增高(OR=2.419,95%CI=1.175-4.977)。(2)rs7193107、rs77700579、rs12925980和rs3751859位点的等位基因频数分布无统计学差异,且在最优遗传模型下,基因型频数分布差异也无统计学意义。(3)由5个SNP位点形成9种单倍型组合,其中由rs12925980-rs2287711-rs3751859-rs77700579组成的单倍型在病例组和对照组中分布有统计学差异(χ~2=23.683,P=0.003),进一步分析结果显示携带TTGT单倍型的人群患精神分裂症的风险降低(OR=0.42,95%CI=0.19-0.94)。6.DBN1基因上2个位点rs2544809和rs2545794的检出率均为97%,且在对照组中均符合HWE(P0.05)。对2个位点分别进行关联分析,结果提示,rs2544809和rs2545794位点的等位基因频数在精神分裂症患者和对照组之间的分布均无统计学差异,在最优遗传模型下,这两个位点的基因型频数在病例组和对照组中分布无统计学差异。然而,由这2个位点组成的单倍型在病例组和对照组中的分布有统计学差异(χ~2=6.861,P=0.032),进一步分析结果显示携带单倍型CC增加精神分裂症的患病风险(OR=1.57,95%CI=1.07-2.30)。7.ZNF385A基因上3个位点rs2700159、rs2887875、rs2706252检出率分别为93%、97%和94%,且在对照组中均符合HWE(P0.05)。分别分析这3个位点与精神分裂症的关联性,结果提示,rs2700159、rs2887875和rs2706252位点的等位基因频数在精神分裂症患者和健康对照组之间分布均无统计学差异,且在最优遗传模型下,这3个位点的基因型频数在病例组和对照组中分布均无统计学差异。由该基因的3个SNP位点组成的3种单倍型的分布亦无统计学差异。8.基因-基因交互作用分析结果显示包含CACNA2D2基因上的rs12496815和rs3806706两个位点的模型为最佳模型,但该模型与精神分裂症无关联(P0.05)。结论:(1)精神分裂症患者外周血中miR-1908-5p的表达水平高于健康对照者。(2)miR-1908-5p在TargetScan、miRDB和DIANA microT三个数据库中共同预测的靶基因有30个,其中CACNA2D2、CMIP、DBN1和ZNF385A 4个基因的mRNA表达在转录组二代测序结果中显著下调,与miR-1908-5p表达显著上调相对应。(3)CACNA2D2基因rs45536634和rs3806706位点多态性均与精神分裂症相关联,rs45536634位点上携带A等位基因或者rs3806706位点上携带GC基因型均会增加精神分裂症的患病风险。(4)CMIP基因rs2287112位点多态性与精神分裂症相关联,携带GG基因型增加患精神分裂症的风险。(5)CMIP基因rs12925980-rs2287711-rs3751859-rs77700579组成的单倍型与精神分裂症相关,携带TTGT单倍型患精神分裂症的风险降低。(6)DBN1基因上2个位点rs2544809和rs2545794组成的单倍型与精神分裂症相关,携带CC单倍型增加精神分裂症的患病风险。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R749.3
【部分图文】：

[25]进行的一项系统综述结果显示男性的发病率高于女性，见图1.1[25]，且男性的发病风险是女性的1.4倍，而另一项关于精神分裂症患病率的研究综述结果却显示终生患病率在男女之间无显著差异[3]，见图1.2[26]。针对我国山东省人群的一项研究结果显示精神分裂症的患病率在性别中无显著差异[18]。我国河北省人群中女性患病率显著高于男性[19]。我国2012年至2015年间完成的一项调查结果显示我国人群中男性和女性的12个月患病率无显著差异[22]。图1.1 不同性别每十万人发病率累积图（截点为100）Fig1.1 Cumulative plots of the incidence rates per 100,000, by sex（plot truncated at 100）.（Resource: Mcgrath J et al， 2004）

4图1.2 不同性别每千人终生患病率累积图Fig 1.2 Cumulative Plots of the Lifetime Prevalence Estimates per 1,000 by Sex（Resource: Sukanta Saha et al，2005 ）⑵ 地区分布McGrath 等完成的两项关于全球调查研究结果的综述显示，城市居民较城乡结合部居民精神分裂症发病率显著增高[25]，见图1.3，而患病率无显著差异[3]，见图1.4。将地区按照经济水平划分后，不发达地区的患病率显著低于新兴和发达地区[25] [26]。我国山东省城市人群患病率（1.21%）高于农村（1.09%），但差异无显著统计学意义[18]。河北省人群中城市和农村人群精神分裂症的患病率无显著差异[19]。广西壮族自治区15岁以上农村居民精神分裂的终生患病率为0.92%[27]

6图1.3 精神分裂症患者亲属罹患精神分裂症的风险Fig.1.3 Lifetime risk of schizophrenia in relatives of people with schizophrenia（Resource：Kahn R S，2015）⑵ 环境因素环境因素主要包括自然环境和社会环境两大类。有研究发现自然环境中病毒或细菌感染引发的脑炎是精神分裂症发病的危险因素[39]，且有研究证明春冬季节是病毒和细菌感染的高发季，而这个季节出生的人群患精神分裂症的风险高于其他时间段出生的人群，间接说明自然环境中的病毒或细菌感染与精神分裂症的患病存在关联。孕妇产期的病毒、细菌感染情况以及营养情况均会影响胎儿的患病情况，国内外许多研究证实孕产期感染病毒或细菌以及孕期营养不良都会增加胎儿患精神分裂症的风险[40, 41]。社会因素也是影响精神分裂症发病情况的一个重要方面。随着城市化程度的不断提高，城市生活环境相比农村成为精神分裂症患病的一个危险因素，这一现象已被很多研究揭示。Lederbogen 等[42]认为社会压力是影响这一现象的中间因素
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1 付颖利;精神分裂症外周血miRNA-1908-5p表达分析及其靶基因与精神分裂症的关联研究[D];吉林大学;2019年

本文编号：2845811