阿片对氨基酸分解代谢关键酶谷氨酸脱氢酶基因表达调控的实验研究

发布时间：2020-10-22 12:12

　　 阿片是历史悠久的镇痛药，但由于其成瘾性使阿片类生物碱中吗啡和海洛因的滥用成为全球性的医学和社会问题。其中海洛因比吗啡有更强的成瘾性。目前对阿片类生物碱成瘾、耐受及戒断机制方面的研究较为深入，而阿片对外周组织的作用研究甚少。本研究的目的是通过研究海洛因对大鼠氨基酸分解代谢关键酶谷氨酸脱氢酶（GLDH）基因表达的调控作用来认识海洛因对大鼠氨基酸分解代谢的影响，以期为阿片类药物的研究增添新的内容。 在研究中我们选用成年雄性Wistar大鼠50只，随机分为5组，每组10只，分别作为生理盐水对照组、3天海洛因依赖组、9天海洛因依赖组、3天自然戒断组和8天自然戒断组。按照剂量逐日递增的原则，生理盐水对照组腹腔注射生理盐水9天后处死，3天海洛因依赖组和9天海洛因依赖组分别腹腔注射海洛因3天和9天后处死，3天自然戒断组和8天自然戒断组均腹腔注射海洛因9天后再分别自然戒断3天和8天后处死。处死大鼠立即采集血浆及组织分别于－20℃冰箱和液氮中冻存。血浆用于测定GLDH酶活性，顶叶、肝脏和小肠组织除测定GLDH酶活性之外还提取其中的总RNA作RT-PCR和Southern杂交来检测该组织中GLDH mRNA的含量。 顶叶组织在海洛因作用后GLDH表达受到抑制。RT-PCR和Southern杂交结果一致显示3天海洛因依赖组、9天海洛因依赖组、3天自然戒断组和8天自然戒断组大鼠顶叶中GLDH mRNA含量均低于对照组，分别为对照组的0.65倍、0.60倍、0.52倍和0.61倍。酶学测定也显示各实验组大鼠GLDH酶活性均低于对照组（p0.01）。这说明海洛因抑制顶叶GLDH基因表达的调控作用发生在转录水平，但不能排除翻译及翻译后水平的调控。顶叶GLDH 活性下降，一方面可能通过减少氨基酸氧化供能而影响脑的正常功能，另一方面还可能由于谷氨酸含量升高而参与戒断反应的发生。 肝脏组织富含GLDH。肝脏组织RT－PCR的结果显示3天海洛因依赖组大鼠肝脏中GLDH mRNA的含量比生理盐水对照组下降，而9天海洛因依赖组大 WP=56 鼠肝脏中GLDH mRNA的含量与3天海洛因依赖组持平，是生理盐水对照组的0.73倍。戒断3天后GLDH mRNA含量有所升高并高于对照组，戒断8天时则降至对照组水平。Southern杂交结果与RT-PCR结果一致，相互印证了结果的可靠性。说明海洛因在转录水平上能够抑制大鼠肝脏GLDH的表达。酶学测定表明，肝脏中GLDH活性在海洛因给药后降低，3天和9天海洛因依赖组肝脏中GLDH活性均低于对照组。戒断3天时，GLDH活性升高并明显高于对照组（p0.05）。戒断8天后GLDH活性降至对照组水平。说明海洛因依赖时GLDH酶活性降低。3天自然戒断组大鼠GLDH活性升高，可能是因为突然停药导致的反跳现象。GLDH mRNA含量变化与GLDH 酶活性变化趋势一致，说明海洛因对肝脏GLDH 基因表达的调控作用发生在转录水平上，但还不能排除翻译及翻译后加工水平上的调控。 小肠是阿片作用的重要靶点之一。阿片类药物减慢胃肠蠕动导致便秘，引起食欲下降等。长期阿片作用，使进食减少并进一步引起营养不良、免疫力低下、体重下降甚至恶病质。戒断后胃肠蠕动过速引发腹泻也是促进体重下降的因素之一。那么机体自身氨基酸的代谢是否参与了体重的变化？从我们的实验结果来看，3天海洛因依赖组与9天海洛因依赖组大鼠小肠组织中GLDH mRNA的含量均明显高于对照组，分别为对照组的1.50倍和3.01倍。自然戒断3天时GLDH mRNA水平降到对照组的1.40倍，自然戒断8天时GLDH mRNA水平是对照组的1.31倍。说明在转录水平上，海洛因诱导了小肠组织GLDH的表达。小肠组织酶学结果显示海洛因用药3天时大鼠小肠中GLDH酶活性无明显变化。给药9天时GLDH酶活性明显升高并高于对照组（p0.05）。在自然戒断过程中，小肠中GLDH酶活性仍明显升高。酶含量与mRNA水平变化不完全一致，说明海洛因诱导小肠GLDH基因表达存在转录、翻译和（或）翻译后水平的多级调控。这种诱导作用很可能通过GLDH 活性的增强而加强氨基酸的分解代谢，参与阿片类药物降低体重及免疫力等作用。 GLDH是细胞内酶，正常生理条件下,血液中GLDH的活性很低。在我们的 WP=57 实验当中，3天海洛因依赖组与9天海洛因依赖组大鼠血浆中GLDH活性均比生理盐水对照组升高(p0.05),并且9天海洛因依赖组血浆GLDH活性高于3天海洛因依赖组。自然戒断后，血浆中GLDH活性下降至低于对照组，到自然戒断8天时又升高并明显高于生理盐水对照组（p0.01）。血浆中GLDH酶活性的升高是组织释放GLDH入血的结果，由此推断，海洛因可能从整个机体水平上增加GLDH基因表达进而促进氨基酸的分解代谢。血浆中GLDH酶活性的升高也可能主要来源于小肠组织，至于海洛因是否影响其他外周组织中GLDH酶活性并进而影响血浆中GLDH酶活性还有待于进一步研究。 综上所述，海洛因诱导GLDH在大鼠小肠中的基因表达，抑制GLDH在顶叶和肝脏中的基因表达。海洛因对大鼠顶叶和肝脏GLDH基因表达的调控主要是在转录水平上，但不能排除存在翻译及翻译后加工的调控。海洛因对大鼠小肠GLDH基因表达的调控存在转录水平、翻译及翻译后加工的多级调控。海洛因依赖和戒断大鼠小肠中GLDH基因表达的增强促进了氨基酸的分解代谢，可能参与了阿片类药物依赖和戒断时体重的下降
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2004
【中图分类】：R749.6
【文章目录】：
英文缩写词表
前言
实验方法
    一、 海洛因依赖及戒断大鼠模型的建立
    二、 血浆及顶叶、肝脏、小肠组织GLDH活性检测
    三、 顶叶、肝脏和小肠组织中GLDH mRNA水平的检测
        1 GLDH 引物的设计
        2 异硫氰酸胍法提取顶叶、肝脏、小肠总RNA
        3 RT-PCR法检测各组织mRNA水平
        4 杂交检测组织mRNA水平
        5 统计学方法
实验结果
    一、 血清GLDH活性
    二、 顶叶GLDH活性
    三、 肝脏GLDH活性
    四、 小肠GLDH活性
    五、 顶叶mRNA 含量
    六、 肝脏mRNA 含量
    七、 小肠mRNA 含量
    八、 顶叶杂交结果
    九、 肝脏杂交结果
讨论
参考文献
中文摘要
英文摘要
致谢

【参考文献】

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本文编号：2851581