跨膜转运蛋白21对引起阿尔茨海默病的γ-分泌酶的作用研究

发布时间：2020-11-15 07:03

　　 γ分泌酶为介导阿尔茨海默氏病(AD)病理改变的关键酶之一。本文研究了转运膜蛋白21(TMP21)的γ分泌酶复合物组分的蛋白表达量及酶活性的影响。 利用核糖核酸干扰和脱氧核糖核酸超表达二次转染技术(siRNA)干扰TMP21在敲除淀粉样前体蛋白表达基因的小鼠胚胎成纤维细胞系(MEF(KO))中的表达。实验选用空质粒载体为对照。处理转染组(T)和对照组(C)细胞,并收集纯化过程中含γ分泌酶复合物的样本:破碎细胞制备全膜蛋白(C_1,T_1):选用CHAPSO进一步溶解后超速离心制备所得蛋白(C_2,T_2);用γ分泌酶组分Presenilin-1(PS-1)的特异性抗体免疫沉降C_2或T_2制备IPC_2和IPT_2。 Western blotting检测γ分泌酶复和物重要组分Nicastrin(NCT),PS-1以及TMP21蛋白表达量;选用饱和浓度的γ分泌酶底物C99,运用ELISA检测Aβpeptide40和Aβpeptide42的生成总量。 研究得到如下结果: 1.取新生鼠脑,用CHO溶解hAPP751转基因鼠脑和PS1-/-细胞运用离心,恒温孵育等手段得到淀粉样蛋白前体-C末端片段(APP-CTF),并运用免疫沉淀(IP),凝胶过滤-高效液相色谱(Gel-HPLC),反向高效液相色谱(PR-HPLC),氨基酸序列分析和质谱(MS)法对APP-CTF的性质进行了研究。研究表明APP-CTF的膜外切割可能存在一种膜外双酶(γ分泌酶和ε分泌酶)切切割机制即可能存在α、β、γ以外的酶切新位点ε。 2.分别用早老蛋白(PS),Nicastrin(NCT),前咽缺陷蛋白-1(APH-1),早老蛋白增强子-2(PEN-2)免疫沉淀(IP)跨膜转运蛋白21(Transmembrane Protein21,TMP21)研究在鼠脑和HEK293细胞细胞系的表达差异。并进一步用蛋白质印迹法分析,结果表明TMP21可能与γ-分泌酶的组成成分Nicastrin(NCT)发生作用,对Aβ40和Aβ42的活性有抑制作用。但是具体的结合区域还是不清楚,有待于进一步的研究工作。 3.本研究构建了TMP21的干扰载体,经检测干扰载体细胞模型构建成功。进行干扰载体检测时研究发现TMP21干扰后,对PS1复合物的影响较大,对Aβ40的产生有较大提高。 4.经TMP21 siRNA处理MEF细胞后,所得样本T1,T2及IPT2所含TMP21的蛋白表达量较相应对照组样本C1,C2和IPC2下降14.8±2.1%,46.5±4.7%及68.9±3.4%,提示转染组MEF细胞中TMP21表达被成功干扰。而转染组和对照组中,构成γ分泌酶复合物的重要组分NCT与PS-1蛋白表达量无明显变化。同时,参照样本C1,C2及IPC2,样本T1,T2及IPT2中所含γ分泌酶活性分别升高13.9%(p=0.24),87.2%(p＜0.001),211.4%(p＜0.001)。 5.经TMP21 cDNA处理MEF细胞后,所得样本T1,T2及IPT2所含TMP21的蛋白表达量较相应对照组样本C1,C2和IPC2上升16.9±2.1%,上升44.7±4.7%及64.5±3.4%,提示转染组MEF细胞中TMP21表达被成功超表达。而转染组和对照组中,构成γ分泌酶复合物的重要组分NCT与PS-1蛋白表达量无明显变化。同时,参照样本C1,C2及IPC2,样本T1,T2及IPT2中所含γ分泌酶活性分别下降11.6%(p=0.24),85.1%(p＜0.001),198.4%(p＜0.001)。 6.有上述结论可以得出:TMP21可与PS-1共沉降,提示TMP21为γ分泌酶复合物的组分之一。MEF细胞中,在TMP21低蛋白表达状态下/高表达状态下,γ分泌酶活性升高/减低,且不影响其他组分的表达水平,提示TMP21为γ分泌酶的负调控因子之一。
【学位单位】：内蒙古大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2008
【中图分类】：R749.16
【部分图文】：

SolubleeytoPlas血eC一terminalfrag功ents班e油rane一assoeiatedPutativeCTFg/111价旧noaffinityPurifieationGel一filtrationHPLC报asssPectro功etryN一termin已a.a.sequeneing分离得到的片段蛋白质印迹结果(图1.1)上旧0.

图1.2CHO溶解的细胞用APP751中，体外进行其APP一CTF的梯度分离鉴定Figure】.5GenerationofCytoPlasmieC一terminalFragmentofAPPinvi介’O一CHOPSI一介中对产生Ap的蛋白质印迹结果(图1.3)PSICl下pCTFQCTF丫I一卜ApPresenilin一KO图l.3PSI敲除后对Ap的影响-

图1.4通过凝胶电泳纯化溶解的和膜上的CTF丫Figurel.4Purifieationofsolubleandmembrane一assoeiatedPutativeCTFgbygel一filtration溶解的C丁卜APP反向高效液相色谱结果(图1.5)由图可知:片段52和53为研究所需要的目的片段(抗体为APP全长抗体)Soluble喂0000CCCCC呢呢呢刀刀刀旧T叫闪O8101214161820Ti此恤动
【参考文献】

相关期刊论文 前3条

1 周建,王小行,高小平,mail.sc.cninfo.net;转移缓冲液对蛋白质印迹的影响[J];生物化学与生物物理进展;2000年03期

2 董燕,张枫,梅柱中,刘斌,孙志贤;电转移中蛋白质的透膜现象及其对蛋白质印迹结果的影响[J];生物化学与生物物理进展;2002年03期

3 梁平,潘阳杏,赵雪梅,杜洪震,张冀民;早老素1基因在转染CHO细胞中的表达及其与γ-分泌酶的关系[J];中华病理学杂志;2005年05期

本文编号：2884486