内生真菌Nodulisporium sp.次生代谢物对不同条件下Aβ42聚集过程的影响研究

发布时间：2017-07-14 02:02

  本文关键词：内生真菌Nodulisporium sp.次生代谢物对不同条件下Aβ42聚集过程的影响研究

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【摘要】：阿尔茨海默病是一种神经退行性疾病,其发病机制有多种学说,其中淀粉样级联学说是主流学说之一。根据淀粉样级联学说,跨膜前体蛋白经剪切可形成含有38~43个氨基酸的淀粉样β蛋白(Aβ)。当Aβ42浓度达到一定程度时,聚集形成寡聚体以及纤维,引起神经突触损伤和炎症发生,导致阿尔茨海默病。其中,Aβ42聚集形成的寡聚体是引起神经细胞毒性的首要原因。因此,抑制Aβ42寡聚体形成或清除Aβ42寡聚体进而阻止其神经细胞毒性,对预防与干预阿尔茨海默病具有重要意义。本实验利用硫磺素-T(Th T)荧光法、SDS-PAGE、原子力显微镜(AFM)扫描等方法对Aβ42聚集过程进行研究,可以看到Aβ42在25℃的10m M PBS(p H=7.4)溶液的寡聚化条件下主要形成二聚体、四聚体、高聚体,而在37℃的10m M HCl(p H2.0)溶液的纤维化条件下可迅速形成纤维,且随时间增加而延长。其中,Th T方法的突出优点是方便、快捷、且灵敏度高,常常被用于从化合物库中高通量筛选可抑制Aβ42聚集的活性化合物。但Th T荧光法并不能区分出Aβ42聚集混合物中的单体、二聚体、四聚体和高分子量寡聚体及Aβ42纤维。SDS-PAGE可有效分离和显示Aβ42形成的各种聚集体,而且可定量分析各种聚集体的变化,是对Th T荧光法的重要补充。AFM方法可测定Aβ42聚集形成的不同颗粒的数量、高度和二维直径与面积,并且与SDS-PAGE电泳中的不同条带之间形成对应关系。本文分析了三种实验方法及其结果,综合反映出Aβ42蛋白聚集过程的变化趋势、各种寡聚体和聚集物的数量及其颗粒的形态变化等,为在体外研究Aβ42聚集形成规律提供了方法。在前期研究中,我们通过Th T荧光法从内生真菌Nodulisporium sp.(No.65-17-2-1)的次生代谢产物筛选出两种结构相似的类黄酮化合物---Demethoxyviridin(Dmv)和Inoterpene B(Inp B),测定Dmv抑制Aβ42聚集活性,其IC50为13.4μM,表明Dmv可能具有抑制Aβ42聚集的活性。本文进一步采用SDS-PAGE和AFM观察方法,研究Dmv和Inp B对Aβ42寡聚化过程的影响。加入Dmv后,可明显降低Aβ42在25℃的PBS溶液聚集过程中的Th T荧光值;SDS-PAGE电泳显示Aβ42单体、二聚体、四聚体和高聚体明显减少,而上样孔内出现更多的不能进入浓缩胶的染色物质;同时,AFM测定颗粒高度大于8nm的无定形大分子聚集物显著增多。而与仅含Aβ42的溶液相比较,Inp B对Aβ42的寡聚化过程几乎没有影响。因此,Dmv在25℃的PBS中促进二聚体、四聚体和高聚体进一步快速聚集成无定形的大分子聚集物。我们进一步研究了Dmv和Inp B对Aβ42纤维化过程的影响。当加入不同浓度Dmv后,可明显降低Aβ42在HCl溶液聚集过程中的Th T荧光值;SDS-PAGE电泳显示Aβ42单体、二聚体和四聚体明显减少,高聚体有所增多,而上样孔内染色物质的数量没有增加;AFM观察到Aβ42纤维的数量和长度都没有明显的改变。当将HCl溶液替换为37℃的纯水(p H=7)后,Dmv也可明显降低Aβ42聚集过程的Th T荧光值;SDS-PAGE显示Aβ42单体、二聚体和四聚体明显减少直至基本消失,高聚体先增加后减少,上样孔内染色物质的数量逐渐增加;AFM可以观察到Aβ42形成了短纤维和大分子聚集物。因此,Dmv在37℃的纯水中可促进Aβ42寡聚体形成短纤维和大分子聚集物。综上所述,Dmv可促进Aβ42寡聚体形成大分子聚集物或短纤维,减少具有神经细胞毒性的寡聚体,从而可能发挥保护神经细胞的作用,为阿尔茨海默病干预和预防研究提供潜在的候选化合物。
【关键词】：阿尔茨海默病 Aβ42寡聚体 大分子聚集物 内生真菌 次生代谢物
【学位授予单位】：深圳大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R749.16
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 第1章 绪论11-22
• 1.1 阿尔茨海默病11-12
• 1.2 β-淀粉样蛋白级联学说12-14
• 1.2.1 Aβ 多肽的来源12-13
• 1.2.2 Aβ 多肽的聚集13-14
• 1.2.3 Aβ 聚集物的细胞毒性14
• 1.3 阿尔茨海默病药物和活性化合物14-17
• 1.3.1 防治阿尔茨海默病的药物15-16
• 1.3.2 陆地动植物和微生物代谢产物16-17
• 1.3.3 海洋动植物代谢产物17
• 1.4 Aβ 蛋白聚集研究方法17-20
• 1.4.1 ThT荧光分析法17-18
• 1.4.2 SDS-PAGE和免疫印迹法18-19
• 1.4.3 原子力显微镜观察19-20
• 1.5 本文研究20-22
• 第2章 材料与方法22-28
• 2.1 材料22-25
• 2.1.1 天然活性化合物及其来源22
• 2.1.2 实验试剂及常用溶液22-24
• 2.1.3 实验仪器24-25
• 2.2 方法25-28
• 2.2.1 Aβ42 多肽在PBS溶液中的寡聚化处理25
• 2.2.2 Aβ42 多肽在HCl溶液中的纤维化处理25
• 2.2.3 ThT荧光分析25-26
• 2.2.4 SDS-PAGE26
• 2.2.5 Western-Blotting26
• 2.2.6 Dot-Blotting26-27
• 2.2.7 原子力显微镜扫描观察27-28
• 第3章 结果与分析28-47
• 3.1 Aβ42 的寡聚化和纤维化过程28-34
• 3.1.1 Aβ42 在PBS溶液中ThT荧光变化28
• 3.1.2 Aβ42 在PBS溶液中聚集的电泳结果28-29
• 3.1.3 Aβ42 在PBS溶液中形成的聚集物被抗体识别结果29-30
• 3.1.4 Aβ42 在PBS溶液中聚集的AFM观察30-31
• 3.1.5 Aβ42 在HCl溶液中ThT荧光变化31-32
• 3.1.6 Aβ42 在HCl溶液中聚集的电泳结果32-33
• 3.1.7 Aβ42 在HCl溶液中聚集的AFM观察33-34
• 3.2 化合物对Aβ42 寡聚化的影响34-40
• 3.2.1 化合物对Aβ42 寡聚化过程Th T荧光的影响34-35
• 3.2.2 化合物对Aβ42 寡聚化影响的电泳结果35-38
• 3.2.3 化合物对Aβ42 寡聚化影响的AFM观察结果38-40
• 3.3 化合物对Aβ42 纤维化的影响40-47
• 3.3.1 化合物对Aβ42 在HCl溶液中聚集过程ThT荧光的影响40-41
• 3.3.2 化合物对Aβ42 在HCl溶液中聚集影响的电泳结果41-42
• 3.3.3 化合物对 Aβ42 在 HCl 溶液中聚集影响的 AFM 结果42-43
• 3.3.4 化合物对 Aβ42 在纯水中聚集过程 ThT 荧光的影响43-44
• 3.3.5 化合物对Aβ42 在纯水中聚集影响的电泳结果44-45
• 3.3.6 化合物对Aβ42 在纯水中聚集影响的AFM结果45-47
• 第4章 讨论47-51
• 4.1 Aβ42 在 PBS 溶液中聚集形成二聚体、四聚体和高聚体47-48
• 4.2 Aβ42 在 HCl 溶液中聚集形成纤维48
• 4.3 Dmv促进Aβ42 寡聚体形成无定形大分子聚集物48-49
• 4.4 三种研究方法综合反映Aβ42 聚集变化过程49
• 4.5 Dmv在HCl中不影响Aβ42 纤维形成49-50
• 4.6 Dmv促进Aβ42 在纯水中形成短纤维和大分子聚集物50-51
• 结论51-52
• 参考文献52-60
• 附录60-61
• 致谢61-62
• 在校期间公开发表论文及著作情况62-63
• 在校期间参加科研项目情况63-64

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：539202