素馨苦苷干预阿尔兹海默症的治疗效果与机制研究

发布时间：2017-09-03 15:01

  本文关键词：素馨苦苷干预阿尔兹海默症的治疗效果与机制研究

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【摘要】：目的:阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease,AD),又名老年性痴呆,是一种使脑功能衰退的神经退行性疾病。患者临床多表现出记忆力、定向力、理解力等障碍,并伴随智力衰退,严重者生活不能自理。其主要病理特征有大脑皮层出现β淀粉样蛋白(Aβ)聚集形成的老年斑(senile plaque,SP)和Tau蛋白过度磷酸化导致神经纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFT)。近年,随着我国老龄人口基数扩增、人口结构老龄化,AD患病率也随之增长,给家庭、社会都带来严重的经济和医疗负担。然而,AD的临床治疗一直面临着缺乏有效药物的困难。因此,深入研究AD发病机理以及寻找可用于临床治疗AD的药物是目前治疗AD的首要任务。素馨苦苷(Jasminin)亦称迎春花素,是一种裂环烯醚萜葡糖苷类(secoiridoid glucosides),其单体具有一定的抑菌活性。有研究表明,Jasminin能诱导RAW264.7细胞分泌TNF-α,并激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路,但Jasminin其在治疗AD方面的研究尚未有报道。本文研究了Jasminin素馨苦苷在体外分子水平上对Aβ_(1-42)聚集的抑制作用,也研究了其在原代神经细胞和转基因AD小鼠上对AD病理相关蛋白表达水平的影响。。方法:采用硫磺素-T(ThT)荧光法,检测不同浓度的Jasminin等九种中药成分对50μmol/L Aβ_(1-42)单体体外聚集及随时间变化的作用效果用;圆二色谱仪(CD)检测2mmol/L Jasminin作用下,Aβ_(1-42)单体体外聚集12小时所形成纤维的结构变化;用原子力显微镜观察与Jasminin共孵育12小时后,Aβ_(1-42)单体体外形成纤维形态及数量变化;以N2A-SW细胞系作为AD细胞模型,用免疫印迹法(Western-blot)检测AD病理相关通路中关键蛋白表达水平的变化;免疫荧光法检测小鼠海马区原代神经元tau蛋白磷酸化(pTau396)和微管(Tubulin)的分布情况。以饮水方式、按100mg/kg/day的剂量给野生型小鼠和3×Tg AD小鼠喂药30天后检测行为学变化以及用Western-blot检测脑组织AD病理相关通路中关键蛋白表达水平的变化。结果:ThT荧光法检测发现,九种中药有效成分单体在高浓度对Aβ_(1-42)体外聚集有抑制效果,其中Ginsenoside Re抑制效果最佳,有效抑制浓度范围在10~00μmol/L;Panaxatriol,Loganin,Ginsenoside Rg1,Jasminin与Artemisinin次之,有效抑制浓度范围在20~100μmol/L;Helicid与Ginsenoside R0效果最差。通过CD谱检测发现Jasminin可以阻碍β-sheet的产生,从而抑制Aβ_(1-42)聚集。采用原子力显微镜观察到Jasminin对Aβ_(1-42)成纤维起抑制作用,纤维形成数量显著减少,延伸速度明显降低。Jasminin降低N2A-SW细胞的APP蛋白表达水平(p=0.0001),增加总tau蛋白(Tau5,p=0.0017)和GSK3β在第9位丝氨酸的磷酸化(GSK3β-pS9,p=0.0082)含量,减少tau在多个位点的磷酸化(Tau-pS396,p=0.0005;Tau-pS422,p=0.0009)和GSK3β在第26位酪氨酸的磷酸化(GSK3β-pY216,p=0.0294)的表达量,从而降低胞内磷酸化水平。此外,Jasminin对突触有保护作用,增加N2A-SW细胞PSD95表达量(p=0.0017),减少神经元Tau-pS396水平,稳定神经元末梢微管结构。喂药30天后3×Tg AD小鼠认知能力有所提高(p=0.0385),Aβ级联通路相关蛋白APP(p=0.0163)、sAPPβ(p=0.0115)、Bace-1(p=0.0085)和Aβ(p=0.0078)在AD鼠脑内含量均有显著性降低;不同位点Tau的磷酸化Tau-pS396(p=0.0207)、Tau-pS404(p=0.0311)和Tau-pT231(p=0.0474)水平降低。结论:Jasminin对Aβ_(1-42)体外聚集及延伸有一定的抑制效果,能明显抑制AD模型细胞N2A-SW中Tau蛋白磷酸化,能降低神经元中Tau蛋白的磷酸化和磷酸化Tau蛋白的聚集、减少病理状态下神经元的损伤。进一步的小鼠实验表明:Jasminin能提高3×Tg小鼠认知能力,降低APP,sAPPβ和Bace-1的表达水平从而减少脑内Aβ含量,减少Tau蛋白在不同位点的磷酸化水平从而阻止AD小鼠脑中NFT的形成。上述结果提示Jasminin值得作为抗AD新药进行深入研究。
【关键词】：阿尔茨海默症 素馨苦苷 β-淀粉样蛋白(Aβ) Tau蛋白
【学位授予单位】：深圳大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R749.16
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-12
• 第1章 文献综述12-23
• 1.1 阿尔茨海默症概述12
• 1.2 AD发病机制概述12-15
• 1.2.1 AD的遗传学基础12-13
• 1.2.2 Aβ 淀粉样蛋白级联假说13-14
• 1.2.3 异常磷酸化Tau蛋白导致的神经纤维缠结假说14
• 1.2.4 其它发病机制假说14-15
• 1.3 AD相关药物的研究进展15-19
• 1.3.1 以氧自由基和炎症为靶点的药物研究16
• 1.3.2 以胆碱能系统为靶点的药物研究16-17
• 1.3.3 以Tau蛋白为靶点的药物研究17-18
• 1.3.4 以Aβ 为靶点的药物研究18-19
• 1.4 中药有效成分治疗阿尔茨海默病的研究19-20
• 1.4.1 中药有效成分对Aβ 的拮抗作用19-20
• 1.4.2 中药有效成分减少Tau蛋白的异常磷酸化20
• 1.5 素馨属植物有效化学成分治疗疾病的研究进展20-21
• 1.6 本实验研究目的和意义21-23
• 第2章 材料及方法23-43
• 2.1 实验材料23-30
• 2.1.1 小鼠模型、细胞模型23
• 2.1.1.1 动物模型23
• 2.1.1.2 细胞模型23
• 2.1.2 实验药物23-24
• 2.1.3 实验试剂及试剂盒24-27
• 2.1.4 实验仪器27-28
• 2.1.5 实验主要试剂的配制28-30
• 2.1.5.1 Western Blot试剂28-29
• 2.1.5.2 细胞免疫荧光试剂29
• 2.1.5.3 细胞系培养试剂29-30
• 2.1.5.4 原代神经细胞培养试剂30
• 2.2 实验方法30-43
• 2.2.1 Aβ_(1-42)的寡聚化处理30
• 2.2.2 Th T荧光法30-31
• 2.2.4 圆二色谱法31-32
• 2.2.5 原子力显微镜扫描观察32
• 2.2.5.1 AFM的Aβ_(1-42)样品制备32
• 2.2.5.2 AFM扫描及结果分析32
• 2.2.6 Western blot检测N2A-SW细胞系AD相关蛋白表达变化32-38
• 2.2.6.1 N2A-SW细胞系的培养32-33
• 2.2.6.2 Western Blot检测N2A-SW细胞系相关蛋白的表达情况33-38
• 2.2.7 新生鼠海马区原代神经元免疫荧光观察38-40
• 2.2.7.1 新生鼠海马区神经元培养38-39
• 2.2.7.2 新生鼠鼠海马区神经元免疫荧光观察39-40
• 2.2.8 小鼠空间探索能力、焦虑情况及学习能力的观察40-43
• 2.2.8.1 小鼠旷场实验40-41
• 2.2.8.2 小鼠电跳台实验41-43
• 第3章 实验结果43-69
• 3.1 九种中药有效成分单体抗Aβ_(1-42)聚集效果筛选43-48
• 3.1.1 Th T荧光法检测中药有效成分单体对Aβ_(1-42)体外聚集的影响43-44
• 3.1.2 九种中药有效成分单体不同浓度下对Aβ_(1-42)聚集的抑制效果44-48
• 3.2 Jasminin对Aβ_(1-42)二级结构的影响48-49
• 3.3 Jasminin抑制Aβ_(1-42)聚集的原子力显微镜观察49-50
• 3.4 Jasminin对AD模型细胞N2A-SW的保护作用50-61
• 3.4.1 Jasminin对N2A-SW细胞活力的影响50
• 3.4.2 Jasminin对N2A-SW细胞内Aβ 通路相关蛋白表达水平的影响50-53
• 3.4.2.1 N2A-SW细胞蛋白浓度的测定50-51
• 3.4.2.2 Aβ 通路相关蛋白表达水平的变化51-53
• 3.4.3 Jasminin对N2A-SW细胞内Tau通路相关蛋白表达水平的影响53-57
• 3.4.4 Jasminin对N2A-SW细胞突触相关蛋白表达水平的影响57
• 3.4.5 Jasminin对海马区神经元内Tau-p S396水平的影响57-59
• 3.4.6 Jasminin对海马区神经元内tubulin表达水平的影响59-61
• 3.5 Jasminin对 3×Tg AD小鼠模型的保护作用61-69
• 3.5.1 Jasminin对 3×Tg AD小鼠模型的空间探索及焦虑情况的影响61
• 3.5.2 Jasminin对 3×Tg AD小鼠学习记忆能力的影响61-62
• 3.5.3 Jasminin对 3×Tg AD鼠脑内Aβ 相关蛋白表达水平的影响62-64
• 3.5.4 Jasminin对 3×Tg AD鼠脑内tau相关蛋白表达水平的影响64-66
• 3.5.5 Jasminin对 3×Tg AD鼠脑内皮层 β 型糖元合成酶激酶3（GSK-3β ）表达水平的影响66-67
• 3.5.6 Jasminin对 3×Tg AD鼠脑内磷酸酶 2（PP2A）表达水平的影响的影响67-69
• 第4章 讨论69-74
• 4.1 Jasminin抑制Aβ_(1-42)体外聚集69-70
• 4.2 Jasminin在N2A-SW细胞和神经元内的治疗效果70-72
• 4.3 Jasminin在 3×Tg AD小鼠脑内的治疗效果72-74
• 第5章 结论74-75
• 参考文献75-80
• 致谢80-81
• 攻读硕士学位期间的研究成果81

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本文编号：785661