分子伴侣介导自噬在阿尔茨海默病中的机制研究

发布时间：2017-09-21 02:30

  本文关键词：分子伴侣介导自噬在阿尔茨海默病中的机制研究

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【摘要】：目的:研究分子伴侣介导的自噬(CMA)对阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)中β-淀粉样蛋白(Amyloid-β,Aβ)清除的机制,探讨靶向调节脑内CMA相关蛋白对AD细胞模型及APPswe/PS1d E9双转基因小鼠认知功能和脑内淀粉样蛋白沉积的影响。方法:1、离体层面:应用HEK293/APPswe细胞(稳定表达人类淀粉样前体蛋白695瑞典型突变的人胚肾细胞)和HEK293/APPwt细胞(稳定表达人类野生型淀粉样前体蛋白695c DNA的人胚肾细胞)模型,通过腺病毒转染技术过表达CMA相关分子或沉默CMA相关分子来检测淀粉样蛋白前体(Amyloid precursor protein,APP)裂解产生的毒性淀粉样肽,并用si RNA技术靶向调节Hsc70和Lamp-2A。采用免疫印迹法或ELISA试剂盒检测细胞内Aβ1-42,Hsc70和Lamp-2A。2、活体层面:选取雄性3月、7月及11月龄APPswe/PS1d E9双转基因小鼠以及其对照同源野生小鼠,通过腺病毒转染技术过表达CMA相关蛋白或沉默CMA相关蛋白来检测淀粉样蛋白前体(Amyloid precursor protein,APP)裂解产生的毒性肽,并用si RNA技术靶向调节Hsc70和Lamp-2A。通过Morris水迷宫测定小鼠空间学习记忆能力,采用Western Blot方法或ELISA法检测小鼠脑内Aβ1-42,Hsc70和Lamp-2A,通过尼氏染色观察神经元形态变化,采用免疫组化观察胞外淀粉样斑的变化。结果:1、离体层面:在表达Aβ的HEK293/APPswe细胞中,CMA被证实参与体外培养细胞内的Aβ降解。当我们利用si RNA使培养细胞中的Lamp-2A或Hsc70低表达时,Aβ水平出现轻微上升,而这些效应在经3-MA处理并移除血清的情况下很明显。相反,Lamp-2A或Hsc70的过表达使得Aβ的聚集降低。这些数据支持了Lamp-2A和Hsc70经CMA依赖性途径参与Aβ清除的理论。2、活体层面:与同月龄对照小鼠相比,我们发现7月龄的APP/PS1小鼠大脑中的Hsc70和Lamp-2A水平出现明显下降,Hsc70水平的改变在11月龄APP/PS1小鼠中更为明显。由此得出,经Lamp-2A或Hsc70-腺病毒处理过小鼠的皮层和海马区域内的平均Aβ沉积明显比对照组低。此外,Morris水迷宫试验证实APPswe/PS1d E9小鼠逃脱潜伏期提高较慢。相反,Lamp-2A或Hsc70-腺病毒处理过的小鼠的空间学习能力得到明显提高,试验中逃脱潜伏期时间缩短。结论:本研究表明CMA对Aβ的清除机制存在作用。有可能为AD患者老年斑的形成开辟一条新的重要途径。同时,靶向调节CMA途径依赖蛋白,可能为AD患者的靶向治疗提供潜在全新方向。
【关键词】：阿尔茨海默病 β-淀粉样蛋白 分子伴侣 自噬
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R749.16
【目录】：

• 摘要2-4
• Abstract4-8
• 引言8-11
• 第一章 材料和方法11-27
• 1.1 仪器与材料11-13
• 1.1.1 主要仪器11
• 1.1.2 主要试剂11-12
• 1.1.3 主要溶液的配制12-13
• 1.2 实验方法13-17
• 1.2.1 细胞系13
• 1.2.2 细胞培养、处理及转染13
• 1.2.3 构建Hsc70或Lamp-2A腺病毒13-14
• 1.2.4 MTT法检测细胞活性14
• 1.2.5 免疫沉淀法14-15
• 1.2.6 Western blot分析Aβ、Hsc70和Lamp-2A表达水平15-17
• 1.3 统计学分析17-18
• 1.4 主要仪器18
• 1.5 主要试剂18-19
• 1.6 实验动物19
• 1.7 实验方法19-27
• 1.7.1 将腺病毒Hsc70或Lamp-2A注入APPswe/PS1d E9双转基因小鼠脑内19-20
• 1.7.2 Morris水迷宫实验20
• 1.7.3 脑组织标本制备20-21
• 1.7.4 溶酶体膜的制备21
• 1.7.5 Western blot21-24
• 1.7.6 酶联免疫吸附法(ELISA)测定Aβ42水平24-25
• 1.7.7 免疫组化染色25
• 1.7.8 免疫荧光染色25-26
• 1.7.9 Nissl染色26-27
• 第二章 结果27-36
• 2.1 CMA参与体外培养细胞内的Aβ降解27-28
• 2.2 Aβ和体外培养细胞中Lamp-2A和Hsc70表达水平的关系28
• 2.3 Lamp-2A和Hsc70对体外培养细胞中Aβ聚集的影响28-30
• 2.4 APPswe/PS1d E9小鼠大脑中CMA蛋白的水平30-31
• 2.5 Hsc70或Lamp-2A经腺病毒重组体向5月龄APPswe/PS1d E9小鼠脑内的有效注入31-32
• 2.6 Lamp-2A或Hsc70过表达对APPswe/PS1d E9小鼠脑内Aβ沉积和神经病理的影响32-34
• 2.7 Lamp-2A或Hsc70过表达对APPswe/PS1d E9小鼠认知功能的影响34-36
• 第三章 讨论36-39
• 结论39-40
• 参考文献40-42
• 综述42-61
• 综述的参考文献58-61
• 攻读学位期间的研究成果61-62
• 致谢62-63

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