24-脱氢胆固醇还原酶（DHCR24）相互作用蛋白的初步筛选研究

发布时间：2017-09-21 02:35

  本文关键词：24-脱氢胆固醇还原酶（DHCR24）相互作用蛋白的初步筛选研究

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【摘要】：阿尔茨海默病(Alzheimer's diseases, AD)是一种缓慢发展的临床上以进行性的认知损害、记忆缺失和人格改变为特征的神经退行性疾病,其与大脑及神经组织中异常的胆固醇代谢有关。24-脱氢胆固醇还原酶(DHCR24)是人体合成胆固醇最终阶段的酶,能够催化链甾醇还原为胆固醇。阿尔茨海默病相关蛋白24-脱氢胆固醇还原酶(DHCR24)是一个广泛表达的,兼具胆固醇合成功能以及抗细胞凋亡等多样化生理功能的蛋白,其神经细胞保护作用得到公认,但其在信号转导通路中的位置和功能尚未明确。为高通量筛选与DHCR24有相互作用的蛋白质,进一步揭示DHCR24影响细胞命运的分子机制,本次实验拟体外表达并纯化获得人源DHCR24蛋白,并在此基础上联合采用以DHCR24蛋白为诱饵的免疫共沉淀联合质谱分析技术及人脑cDNA文库T7噬菌体展示技术,初步筛选与DHCR24发生相互作用的候选蛋白。首先,我们以质粒pcDNA3.1a-DHCR24和pT7CFE1-CHis为原料构建质粒PT7CFE1-HIS-DHCR24,通过蛋白体外表达系统得到过表达的DHCR24蛋白。利用免疫沉淀技术用已知可以和DHCR24相互作用的MDM2蛋白验证体外表达的DHCR24的功能；DHCR24功能得到确认后,进行免疫共沉淀联合蛋白质谱实验并进行分析,得到了部分可能与DHCR24相互作用的候选蛋白质。另外,我们再以体外表达得到的DHCR24进行蛋白包被,使用人脑cDNA文库T7噬菌体展示技术,筛选与DHCR24相互作用的蛋白质。将两部分得到的数据进行综合分析,确定与DHCR24存在相互作用的候选蛋白质。综上所述,本论文以pT7CFEl-HIS-DHCR24重组质粒的DHCR24蛋白体外蛋白表达及纯化为基础,证明重组质粒体外过表达的DHCR24具有良好的与其相互作用蛋白结合活性,并进行了以DHCR24蛋白为诱饵蛋白的免疫沉淀联合质谱分析筛选DHCR24互作候选蛋白和噬菌体展示实验并初步确定了与DHCR24相互作用的候选蛋白,为进一步研究DHCR24相互作用蛋白并理解DHCR24的神经保护作用的机制奠定了基础。
【关键词】：阿尔兹海默病 DHCR24 噬菌体展示技术
【学位授予单位】：辽宁大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R749.16
【目录】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-12
• 引言12-17
• 0.1 DHCR24蛋白的发现12-13
• 0.2 DHCR24及其保护作用13-14
• 0.3 DHCR24与P53和MDM2之间的相互作用14
• 0.4 DHCR24拓扑结构,调整机制以及甲基化方面的研究14-15
• 0.5 蛋白互作筛选技术15
• 0.6 研究的目的意义15-17
• 第1章 重组质粒PT7CFE1-His-DHCR24的构建17-27
• 1.1 引言17-18
• 1.2 实验材料18-19
• 1.2.1 生化试剂耗材18
• 1.2.2 主要仪器设备18-19
• 1.2.3 试剂的配制19
• 1.3 实验方法19-24
• 1.3.1 pcDNA3.1a-DHCR24和pT7CFE1-CHis质粒的转化、扩增19-22
• 1.3.1.1 质粒转化19-20
• 1.3.1.2 质粒小量提取20-21
• 1.3.1.3 质粒酶切验证21
• 1.3.1.4 质粒中提扩增21-22
• 1.3.2 片段回收22-23
• 1.3.3 酶连重组23-24
• 1.3.4 重组质粒的酶切验证和序列测定24
• 1.4 实验结果与讨论24-25
• 1.5 结论25-27
• 第2章 1-Step Human Coupled IVT Kit实现DHCR24体外表达及功能验证27-36
• 2.1 引言27
• 2.2 实验材料27-28
• 2.2.1 生化试剂及耗材27-28
• 2.2.2 试剂的配制28
• 2.3 实验方法28-33
• 2.3.1 1-Step Human Coupled IVT Kit-DNA表达DHCR2428-29
• 2.3.2 Western Blot检测DHCR24蛋白的表达29
• 2.3.3 免疫共沉淀验证表达DHCR24功能29-33
• 2.3.3.1 N2A细胞复苏传代、冻存30-31
• 2.3.3.2 DHCR24与MDM2的免疫共沉淀31-32
• 2.3.2.2 Western Blot检测DHCR24与MDM2相互作用32-33
• 2.4 结果与讨论33-35
• 2.4.1 1-Step Human Coupled IVT Kit-DNA表达DHCR24的验证33-34
• 2.4.2 Western Blot检测DHCR24和MDM2蛋白的相互作用34-35
• 2.5 结论35-36
• 第3章 免疫共沉淀联合质谱分析技术筛选DHCR24互作蛋白36-55
• 3.1 引言36
• 3.2 实验材料36-37
• 3.2.1 生化试剂及耗材36-37
• 3.2.2 试剂的配制37
• 3.3 实验方法37-43
• 3.3.1 Ad293细胞复苏、传代及总蛋白的提取37-39
• 3.3.1.1 Ad293细胞复苏37-38
• 3.3.1.2 Ad293细胞传代38
• 3.3.1.3 Ad293细胞冻存38
• 3.3.1.4 Ad293细胞总蛋白的提取38-39
• 3.3.2 1-Step Human High-Yield Mini IVT Kit表达DHCR2439-41
• 3.3.2.1 高效表达DHCR24蛋白39-40
• 3.3.2.2 BCA法测定表达DHCR24蛋白的浓度40
• 3.3.2.3 免疫共沉淀法沉淀DHCR24相互作用蛋白40-41
• 3.3.3 蛋白质谱法检测DHCR24相互作用蛋白41-43
• 3.3.3.1 免疫共沉淀样本的考马斯亮蓝染色41-42
• 3.3.3.2 免疫共沉淀胶点蛋白的蛋白质谱42
• 3.3.3.3 免疫共沉淀样本全蛋白的蛋白质谱42-43
• 3.4 结果与讨论43-54
• 3.4.1 免疫共沉淀样本考马斯染色分析43
• 3.4.2 免疫共沉淀特异条带质谱分析43-44
• 3.4.3 免疫共沉淀全蛋白质谱鉴定差异分析44-54
• 3.5 结论54-55
• 第4章 噬菌体展示技术筛选DHCR24相互作用蛋白55-66
• 4.1 引言55
• 4.1.1 噬菌体展示技术55
• 4.1.2 蓝白斑筛选55
• 4.2 实验材料55-56
• 4.3 实验方法56-62
• 4.3.1 大肠杆菌BLT5403的扩增和保存56-57
• 4.3.1.1 大肠杆菌BLT5403的复苏56-57
• 4.3.1.3 大肠杆菌BLT5403的保存57
• 4.3.2 T7噬菌体的扩增和保存57
• 4.3.3 噬菌体的滴度测定57-58
• 4.3.3.1 T7原始噬菌体滴度测定57-58
• 4.3.3.2 扩增后的T7噬菌体滴度测定58
• 4.3.4 噬菌体展示技术可行性实验58-59
• 4.3.5 阳性对照实验59-60
• 4.3.6 DHCR24蛋白的包被和生物淘洗60-61
• 4.3.6.1 DHCR24蛋白的包被60
• 4.3.6.2 生物淘洗60-61
• 4.3.7 噬菌体筛选的PCR61
• 4.3.8 噬菌体筛选片段的TA克隆61-62
• 4.4 结果与讨论62-65
• 4.4.1 人脑cDNA文库T7噬菌体的初始浓度测定结果62
• 4.4.2 人脑cDNA文库T7噬菌体的扩增后的浓度测定结果62
• 4.4.3 噬菌体展示技术可行性实验结果62-63
• 4.4.4 噬菌体展示阳性对照实验结果63
• 4.4.5 生物淘洗过程中的噬菌体滴度测定结果63-64
• 4.4.6 噬菌体筛选的PCR64-65
• 4.5 结论65-66
• 第5章 结果与展望66-68
• 致谢68-69
• 参考文献69-71
• 攻读学位期间发表学术论文及参加科研情况71

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 宋铭晶;董伟;全雄志;施海霞;黄澜;张连峰;;心脏特异表达Dhcr24转基因小鼠的建立和表型分析[J];中国比较医学杂志;2008年05期

2 谭来勋;孙圣刚;张双国;;不同发育时期大鼠脑海马区胆固醇对发育与成熟的意义(英文)[J];中国临床康复;2005年36期

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本文编号：891889