Nell-1对人牙髓细胞炎性因子表达的调节作用及其机制的体外研究

发布时间：2017-11-12 08:09

  本文关键词：Nell-1对人牙髓细胞炎性因子表达的调节作用及其机制的体外研究

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【摘要】：目的：Nell-1蛋白(Nel-like molecule-1)是一种于颅缝早闭患者的早闭区发现的新型分泌蛋白。Nell-1对成骨细胞分化、矿化及骨的形成、再生有明显的诱导作用。最新研究发现Nell-1蛋白可抑制BMP-2诱导的骨组织炎症反应,减轻BMP-2在诱导骨形成时的副作用。牙体组织和骨组织在组织来源上具有同源性(均来源于神经嵴),基因结构上具有许多相似性,由此推测Nell-1蛋白可能参与调控牙髓炎中炎性因子的表达。本实验拟通过体外实验初步探索人重组Nell-1蛋白(简称Nell-1蛋白)对内毒素脂多糖(LPS)诱导的人牙髓细胞相关炎性因子(IL-6、IL-8)表达的调节作用及其可能的机制。材料和方法：1、利用酶消化组织块法培养人牙髓原代细胞,用第4-6代牙髓细胞进行后续实验。2、将人牙髓细胞与浓度分别为0、100、200、4OOng/ml的Nell-1蛋白及lOng/mlLPS共培养24小时。并设立空白对照组。利用实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测IL-6、IL-8相关基因的表达,初步探索Nell-1对人牙髓细胞炎性因子表达的作用并确定Nell-1的最低有效作用浓度。3、利用Nell-1的最低有效作用浓度(200ng/m 1)和lOng/ml LPS共同作用人牙髓细胞,分别培养3小时、6小时、12小时、1天、3天、7天,利用qRT-PCR和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测IL-6、IL-8在不同时间点上mRNA及蛋白表达情况。4、将人牙髓细胞与200ng/ml Nell-1蛋白、lOng/ml LPS、10μmol/L MAPK蛋白激酶抑制剂共培养24小时,通过qRT-PCR检测IL-6、IL-8的mRNA表达情况。结果：1、利用组织块酶消化法成功培养出了牙髓原代细胞,进行传代培养后获得了状态良好的牙髓细胞。2、用不同浓度梯度的Nell-1蛋白和10ng/mlLPS处理牙髓细胞24小时,发现10ng/mlLPS对牙髓细胞中IL-6、IL-8的表达具有明显诱导作用(p0.01)。与对照组相比,200ng/mlNell-1蛋白可显著抑制牙髓细胞中IL-6(p0.05)、IL-8(p0.01)的表达。3、用200ng/mlNell-1蛋白和10ng/mlLPS处理牙髓细胞3小时、6小时、12小时、24小时、3天、7天,发现LPS的致炎作用具有时间依赖性,在3天组致炎作用最强,7天组的致炎作用却有所降低。在24小时、3天组Nell-1对炎性因子的表达有明显的抑制作用,在3小时、6小时、12小时、7天组抑制作用不明显。4、加入MAPK蛋白激酶抑制剂后发现ERK MAPK和p38 MAPK蛋白激酶抑制剂可明显抑制Nell-1蛋白对IL-6、IL-8炎性因子表达的负调节作用,JNK MAP蛋白激酶抑制剂对Nell-1的抑炎作用无明显影响。结论：1、组织块酶消化法培养牙髓细胞的方法操作步骤简单,培养出的牙髓原代细胞形态复杂多样,经过传代培养纯化后的细胞外形形态均一、生长状态良好,增殖迅速,适宜用于后续实验研究。2、用10ng/mlLPS成功建立了牙髓炎模型,Nell-1蛋白对牙髓细胞中LPS诱导的炎性因子的表达具有抑制作用,该抑制作用具有剂量和时间依赖性。3、Nell-1对牙髓细胞炎性因子的抑制作用可能由MAPK信号通路中的ERK和p38信号共同参与调控。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R781.3

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本文编号：1175046