涎腺腺样囊性癌中低氧与自噬相关基因的生物信息学研究

发布时间：2017-12-04 21:40

  本文关键词：涎腺腺样囊性癌中低氧与自噬相关基因的生物信息学研究

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【摘要】：研究背景：生物信息学是一门交叉学科,是结合数学、计算机科学、统计学、工程学来处理生物学数据、研究生物学问题的新兴学科,现已在分子生物学的各个领域发挥着重要作用。生物信息学在医学生物学中最广泛的应用之一,就是在分析基因和蛋白表达、功能注释以及调控机制的研究中,起到非常积极的作用；在遗传学及基因组学领域,生物信息学技术可以帮助人们在测序和注释基因组,以及和基因组相关的可变剪切、突变等方面获得更多信息；生物信息学图形技术,例如图像及信号处理技术,允许科研人员从大量原始数据中提取有用的结果；在文本挖掘生物学文献、生物学数据查询中,生物信息学同样扮演重要角色。目前生物信息学几个重要的研究方面,包括表观遗传组学、基因组学、转录组学、蛋白组学、代谢组学等,在肿瘤研究中都有广泛的应用。其中,代表基因表达数据的转录组学是应用的最为广泛的一个方向。包含有数万个基因表达情况的的转录组数据,反映了细胞或组织即刻的生理病理状态,同时反映了这一过程中基因的活动信息；通过对比不同条件或不同组织来源的基因表达情况,可以反应内在的基因层面的联系,在寻找生物标志物,探究疾病机制机理、评价药物及其他治疗手段效果等方面都有重要作用。目前,基因芯片是生物医学研究中最常用的高通量基因检测的手段之一。基因芯片,是微观DNA点粘附在固体表面的集合,用芯片同时检测大量基因表达水平或基因组多个区域的基因型。由于芯片包含数以万计的探针,基因芯片实验能够完成许多并行基因测试,在生物医学研究中,一方面可以通过运用基因芯片,研究各类疾病发生发展的内部机制,建立调控网络；另一方面也可以应用于寻找疾病的标志物和治疗靶点,因此基因芯片技术极大地加速了很多疾病的研究。在现有的肿瘤研究,如肺癌、胃癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌、头颈鳞癌等各类癌症的研究中,基因芯片的应用非常广泛,然而,在涎腺腺样囊性癌中,基因芯片的应用相对较少。腺样囊性癌是一种较为少见的恶性肿瘤,可发生在身体的许多部位,最常发生在头颈部,尤其是涎腺,相对于粘液表皮样癌、多形性腺瘤,腺样囊性癌是最常见的涎腺恶性肿瘤之一。腺样囊性癌易复发,易远处转移,同时早期即有侵犯神经等较为独特的生物学行为,目前主要的治疗手段是手术联合放化疗的综合治疗,接受手术的原发腺样囊性癌病例的五年、十年、十五年、二十年、二十五年的生存率分别为77.3%,59.6%,44.9%,35.0%,25.5%,总体疗效仍然不能令人满意。近年来,随着生物医学研究的逐步深入,人们对于腺样囊性癌的发生发展的研究取得了很大的进展。许多原癌基因、抑癌基因被发现参与了肿瘤的发生和发展过程,与此同时,也有很多生物学信号通路被发现在涎腺腺样囊性癌中过度的活跃或抑制,如mTOR信号通路、NOTCH1信号通路、p53信号通路等等。自噬是在组织微环境较为恶劣的情况下,细胞内的物质成分通过溶酶体被降解,在自噬溶酶体中,待降解物质在各种酶和蛋白的作用下,分解成氨基酸和核苷酸等,通过三羧酸循环,产生可以被重新利用的小分子,是细胞内的一种自我保护机制。在生物进化过程中,自噬这一生物学过程非常保守,广泛的存在于真核细胞的胚胎发育、炎症、氧化应激、低氧、缺血等各种生理或病理过程中。自噬与肿瘤的关系同样是自噬研究中的一个热点问题,现有的研究发现,自噬可能参与到了肿瘤发生、发展、侵袭、转移等众多环节。而在自噬的启动方面,低氧是报道最多的环境因素。低氧作为肿瘤发展过程中不可避免的微环境之一,对肿瘤的进展起到了非常重要的作用。在低氧条件下,肿瘤细胞通过改变某些调控因子和蛋白,激活特定的信号通路来调节肿瘤细胞的生物学活动,这其中就包括自噬。很多学者发现,在肿瘤中低氧可以诱导自噬,上调自噬水平,从而促进肿瘤细胞的生存,同时促进肿瘤的生长,在结肠癌、胃癌、前列腺癌中,都有大量关于低氧诱导自噬的相关报道。在这一过程中,低氧诱导因子1 α作为细胞应对低氧微环境的重要转录因子,通过对靶基因进行转录调控进而调控相应蛋白的表达,在调节低氧诱导的自噬中起重要作用。因此在低氧诱导自噬这一生物信号通路中,低氧诱导因子1α的表达与自噬基因的关系,很大程度上反应了低氧与自噬的内在联系,是研究低氧自噬的关键。我们课题组前期实验中,发现低氧自噬相关基因在涎腺腺样囊性癌中表达活跃,与肿瘤的生存及转移有一定的相关性。然而,涎腺腺样囊性癌中,用生物信息学技术在基因整体表达水平上对低氧自噬的分析尚未有相关报道。研究目的：在我们课题组的前期研究中,自噬信号通路与涎腺腺样囊性癌的预后有显著的相关性,因此在本研究中,我们在前期实验的基础上,利用生物信息学手段,重点研究自噬这一信号通路在涎腺腺样囊性癌中的表达情况,并分析自噬信号通路在基因水平上的富集情况,探索在涎腺腺样囊性癌低氧自噬中,低氧诱导因子1α与自噬相关基因的关系,以期对其在涎腺腺样囊性癌中的作用及调节机制有更深入的研究。研究方法：1.从GEO数据库筛选、下载并预处理相关数据集,获得涎腺腺样囊性癌的基因表达数据。2.应用R语言,Wilcoxon秩和检验进行差异表达基因分析。3.进行文献检索,收集整理自噬相关基因。4.应用超几何分布检验进行自噬通路的富集分析。5.对低氧诱导因子1α基因与自噬基因进行相关分析,并选择有正相关性的一个自噬基因作为靶基因,作为下一步的研究对象。6.应用免疫组织化学染色法检验涎腺腺样囊性癌组织中低氧诱导因子1α基因与靶基因对应的蛋白表达情况。7.应用二氯化钴在细胞系ACC-M中构建低氧模型,通过免疫荧光技术,检测是否有自噬的产生。8.应用二氯化钴在细胞系ACC-M中构建低氧模型,作用0小时、6小时、12小时、24小时后,应用R T-PCR技术,Western blot技术检测低氧诱导因子1α基因与靶基因的表达是否具有一致性。研究结果：1.在数据集GSE59701中,共有20201个基因的表达值,以表达值差异超过2倍或者小于0.5倍,P值小于0.05为筛选条件,共筛选出764个上调基因,占总基因数的3.78%；545个下调基因,占总基因数的2.70%。2.根据文献收集整理出26个自噬相关基因。3.在上调表达基因中,以P值小于0.05为筛选条件,对以上26个自噬相关基因簇进行富集分析,P值等于0.008223,判定该通路上调；在下调表达基因中,对以上26个自噬相关基因簇进行富集分析,P值等于0.446729,无法判定该通路为下调。4.采用了Spearman相关系数,P值小于0.05为筛选条件,有五个基因ATG3、ATG4A、ATG5、PIK3R4和MAP1LC3B与低氧诱导因子1α基因的表达显著正相关。5.选择MAP1LC3B为靶基因。71例涎腺腺样囊性癌患者的肿瘤组织切片中,进行免疫荧光检测发现,53例可以观察到低氧诱导因子1α表达阳性,40例可以观察至MAP1LC3B对应蛋白表达阳性,25例患者中,低氧诱导因子1α与MAP1LC3B对应蛋白同时表达阳性。6.选取200μmol/ L的二氯化钴为作用浓度,对ACC-M细胞作用24小时后,通过免疫荧光技术检测证实,可以诱导ACC-M细胞株中自噬体的产生。7.选取200u mol/L的二氯化钴为作用浓度,对ACC-M细胞作用0小时、6小时、12小时、24小时后,通过RT-PCR检测与Western blot检测证实,低氧诱导因子1 a与基因MAP1LC3B在基因水平和蛋白水平中表达一致性上调。研究结论：本研究显示,涎腺腺样囊性癌中自噬信号通路在基因水平上明显上调,低氧诱导因子1α基因与ATG3、ATG4A、ATG5、PIK3R4 和 MAP1LC3B五个基因自噬基因的表达有正相关性,表达趋势一致。经临床及细胞学实验验证,在低氧状态下,基因MAP1LC3B与低氧诱导因子1α基因的基因表达水平与蛋白表达水平的确存在着一致性上调现象,为涎腺腺样囊性癌下一步的基础研究和临床治疗提供了新的思路,但其具体调控机制仍有待进一步的探索。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.8

【共引文献】

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1 杨晨;李萍;梁廷明;;细胞自噬与肿瘤的关系研究进展[J];生命科学;2015年02期

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1 王丹丹;介孔二氧化硅纳米微粒共转运Doxorubicin和MDR1-siRNA治疗耐药口腔鳞状细胞癌的研究[D];吉林大学;2015年

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本文编号：1252440