变形链球菌耐氟菌株及其亲代菌株耐酸groE操纵子甲基化差异的比较

发布时间：2017-12-06 09:20

  本文关键词：变形链球菌耐氟菌株及其亲代菌株耐酸groE操纵子甲基化差异的比较

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【摘要】：目的:龋病是以细菌感染为主,多种因素共同作用引起的牙体硬组织疾病。龋病慢性进行性发展,破坏牙体硬组织,会造成牙体组织在色、形、质等方面的改变,该过程不可逆。龋病是常见多发的口腔疾病,早在上世纪七十年代,就被世界卫生组织列为严重威胁人类健康的三大疾病之一。在多种龋病致病菌中,变形链球菌的致病性最强[1-3],所以学者们对龋病的研究多围绕变形链球菌展开。近年来,氟化物防龋取得了较好的临床效果,现已广泛应用于临床,这种做法的弊端是导致了耐氟菌株的选择性生长[4]。目前,学者对变形链球菌耐氟菌株耐酸相关基因ffh、dfp、dlt C、dnaK[5-7]等都已进行了基因突变位点的检测,并且运用氟化物成功的诱导出耐氟突变菌株[8]。耐氟菌株产酸和耐酸的能力均强于亲代菌株,导致了突变菌株致龋性增强[9-10],这与耐酸基因的突变有一定的关联。DNA甲基化是一种常见的表观遗传学现象,它是DNA甲基转移酶催化的一种基因修饰,将S腺苷甲硫氨酸的甲基置换到DNA分子中的碱基上。大量研究显示,DNA甲基化能够引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变,从而调控基因的表达[11]。这种DNA修饰的方式并没有改变基因的碱基序列,但是由此调控了基因的表达[12]。目前,变形链球菌UA159及其耐氟菌株UA159-FR全基因组序列已提交至Genbank数据库,登录号分别为AE014133[13]、CP007016[14]。结果显示groEL-groES无碱基突变。在酸应激时,groEL-groES受到激发,GroEL分子伴侣表达,辅助蛋白质的组装、折叠、转运和降解,增强了对酸的适应性,这与基因突变不相关,但与基因表观遗传学修饰——基因甲基化水品是否相关仍不清楚。本实验通过检测变形链球菌耐氟菌株与其亲代菌株基因甲基化水平是否改变,进一步揭示变形链球菌耐氟菌株的致龋机制,为氟化物防龋的临床应用提供理论依据。方法:1.利用氟化物诱导变形链球菌耐氟菌株(S.mutans UA159-FR)。2.变形链球菌(s.mutansua159)及其耐氟菌株(s.mutansua159-fr)的培养。3.s.mutansua159-fr16srdna菌种鉴定。4.s.mutansua159及s.mutansua159-fr全基因组提取。5.s.mutansua159-fr目的基因groel-groespcr扩增。6.构建重组质粒:s.mutansua159-fr目的基因groel-groes的pcr扩增产物与pmd-18t载体进行ta连接,并转化入大肠杆菌感受态细胞dh5α中扩增。7.裂解感受态大肠杆菌,提取重组质粒,用pstⅠ及hindⅢ双酶切进行重组质粒的鉴定。8.s.mutansua159-fr目的基因groel-groes送检测序。9.s.mutansua159及s.mutansua159-fr全基因组送检,groel-groes基因甲基化检测,比较两者甲基化水平的差异。结果:1.成功的诱导并培养了变形链球菌耐氟菌株(s.mutansua159-fr)。2.菌种s.mutansua159及s.mutansua159-fr16srdna菌种鉴定成功。3.目的基因groel-groes与pmd18-t载体连接成功,构建了重组克隆质粒,并实现重组质粒在大肠杆菌感受态细胞dh5α中的扩增。4.完成基因测序,将结果与genbank上公布的s.mutansua159目的基因groel-groes序列进行blast比对,发现变形链球菌耐氟菌株目的基因groel-groes与亲代基因序列完全相同,无突变发生。5.完成目的基因的甲基化检测,结果显示变形链球菌耐氟菌株groel-groes甲基化水平与亲代基因甲基化水平相当,不存在明显差异。结论:本实验成功构建了变形链球菌耐氟菌株耐酸相关基因groel-groes重组质粒,并进行菌种鉴定、基因测序及变形链球菌耐氟菌株与亲代菌株基因甲基化水平检测,发现变形链球菌耐氟菌株与其亲代菌株相比基因未发生突变,并且基因甲基化水平未发生变化,变形链球菌耐氟菌株耐酸性增强与其耐酸相关基因groel-groes的基因突变和甲基化水平无明显的联系,为进一步揭示变形链球菌耐氟菌株的致龋机制提供理论依据,对氟化物防龋的临床应用有指导意义。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R781.1

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1 牛雪微;变形链球菌耐氟菌株及其亲代菌株耐酸groE操纵子甲基化差异的比较[D];吉林大学;2016年

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本文编号：1258094