牙龈卟啉单胞菌c-di-AMP代谢相关基因的克隆及表达纯化

发布时间：2017-12-06 09:24

  本文关键词：牙龈卟啉单胞菌c-di-AMP代谢相关基因的克隆及表达纯化

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【摘要】：目的克隆牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)中负责c-di-AMP代谢的相关基因,并使其在大肠杆菌中正确表达及高效纯化。方法通过聚合酶链反应(PCR)克隆牙龈卟啉单胞菌ATCC33277的pgn0523、pgn1187和pgn2003三个基因,经过酶切后将目的基因片段与大肠杆菌表达质粒p ET28a连接,分别构建出重组表达质粒p ETpgn0523、p ET-pgn1187和p ET-pgn2003。将重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白,通过十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析和鉴定。用镍离子金属亲和层析法对重组蛋白进行分离纯化,BCA法检测目的蛋白的浓度。结果目的基因pgn0523、pgn1187和pgn2003扩增产物条带与预期大小一致。重组表达质粒p ET-pgn0523、p ET-pgn1187和p ET-pgn2003及其PCR产物琼脂糖凝胶电泳验证与预期大小相符,测序结果与Gen Bank中牙龈卟啉单胞菌ATCC33277国际标准菌株的基因序列100%一致。IPTG诱导后的菌体经SDS-PAGE检测得到3个大小分别为19.5×103、39.9×103、66.0×103的蛋白质增强条带,与预期大小相符。镍离子金属亲和层析柱纯化得到的蛋白与预期目的蛋白分子量一致,BCA法测定目的蛋白的浓度分别为0.708、0.523和0.861 mg·m L-1。结论本研究成功克隆并表达纯化了牙龈卟啉单胞菌c-di-AMP代谢相关蛋白,得到了较高浓度和纯度的目的蛋白,为进一步探究牙龈卟啉单胞菌c-di-AMP的生理功能及体内代谢途径奠定了基础。
【作者单位】： 口腔疾病研究国家重点实验室华西口腔医院(四川大学);
【基金】：国家自然科学基金资助项目(31200985)
【分类号】：R780.2
【正文快照】： c-di-AMP[1]是近些年继c AMP、c-di-GMP后新发现的一种在细菌和支原体中广泛存在的环核苷酸第二信使分子,这些细菌包括枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)[1-3]、单核增生李斯特菌(Listeria monocy-togenes)[4-6]、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus au-reus)[7]、肺炎链球菌(Strept

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