富血小板纤维蛋白凝胶作为牙髓再生支架的体外实验研究

发布时间：2017-12-17 05:05

  本文关键词：富血小板纤维蛋白凝胶作为牙髓再生支架的体外实验研究

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【摘要】：目的：通过体外分析富血小板纤维蛋白(plate-rich fibrin, PRF)凝胶的三维结构及其生长因子的释放规律、评价不同浓度PRF凝胶析出液对人牙髓细胞(human dental pulp cells, hDPCs)增殖的影响、探索PRF-hDPCs复合体制备方法,评估PRF凝胶作为牙髓组织再生支架的可行性。方法：1.实验一：采用Choukroun一步离心法制备PRF凝胶分别行组织学和扫描电镜(scanning electron microscope, SEM)观察。将PRF凝胶(PRF组)、PRF凝胶上半部分(PRF upper组)、PRF凝胶下半部分(PRF lower组)分别浸泡于DMEM培养基中,于24 h、72h、120 h、168 h、216 h收集析出液。通过酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)测定各组PRF凝胶释放PDGF-BB、TGFβ1、IGF1、FGF2的浓度。2.实验二：采用组织块法进行hDPCs体外分离培养,免疫组织化学染色法检测波形丝蛋白、角蛋白的表达。将新鲜制备的PRF凝胶浸泡于DMEM培养基中,于第7天取析出液。分别用含PRF凝胶析出液浓度(体积分数)为25%(1PRF组)和75%(3PRF组)的条件培养基培养hDPCs。采用细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8, CCK-8)检测24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h、168 h各时间点的细胞增殖活性。3.实验三：分离培养hDPCs。用Choukroun一步离心法制备PRF凝胶。取PRF凝胶制备过程中的不同时间点,即离心前、离心后立即和离心后10min,分别于离心管血液中加入hDPCs混悬液,制备hDPCs-PRF复合体。将复合后的hDPCs-PRF分别行组织学和SEM观察。采用免疫组织化学染色鉴定细胞来源。将使用上述方法复合后的hDPCs-PRF置入细胞培养箱中培养,7天后固定行H-E染色。结果：1.组织学观察结果表明PRF凝胶由纤维蛋白基质、白膜层及下端粘连的少量红细胞三部分构成,白细胞主要分布于白膜层底部,SEM显示白膜层由粗大而密集的纤维条索构成。ELISA结果表明,PRF凝胶可缓慢释放一定量的PDGF-BB、TGFβ1、FGF2、IGF1,在大多数时间点PRF lower组生长因子释放量高于PRF组,差异有统计学意义(P0.05),而PRF upper组几乎不释放生长因子。2.CCK-8结果显示,在24 h、48 h、72h、96 h, 1PRF组和3PRF组的光密度值与对照组相比,差异无统计学意义(P0.05)；在120 h、144 h、168 h,1PRF组和3PRF组的光密度值高于对照组,差异有统计学意义(P0.05);1PRF组的光密度值和3PRF组相比,差异无统计学意义(P0.05)。3.在离心前组,组织学和SEM可见PRF凝胶内有体积大于正常血细胞且形状不规则的细胞分布于白膜层,该细胞呈波形丝蛋白阳性,CD45和CD68阴性表达；培养7天后,H-E染色可见PRF凝胶内有长梭形细胞的集落形成,部分梭形细胞沿着白膜层和纤维蛋白凝胶的交界分布。在离心后和离心后10分钟组,组织学和SEM均未发现有上述细胞存在于PRF凝胶。结论：1.PRF凝胶由纤维蛋白基质、白膜层及下端粘连的少量红细胞三部分构成,可作为生长因子缓释系统；2.PRF凝胶析出液可促进hDPCs体外增殖；3.在PRF凝胶制备过程中,离心前往血液中加入hDPCs混悬液可将hDPCs嵌合到PRF凝胶的白膜层中,并且hDPCs在PRF凝胶支架中生长状况良好。4.PRF凝胶有望成为牙髓再生良好的支架材料。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R783.1

【参考文献】

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1 Sibel Yildirim;Susan Y. Fu;Keith Kim;Chang Hun Lee;Sahng Gyoon Kim;Jeremy J. Mao;;Tooth regeneration: a revolution in stomatology and evolution in regenerative medicine[J];International Journal of Oral Science;2011年03期

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本文编号：1298821