成牙本质细胞极性相关蛋白cdc42和E-cadherin的表达及功能
本文关键词: 成牙本质细胞 细胞极性 细胞连接 细胞分裂周期蛋白42 出处:《第四军医大学》2014年硕士论文 论文类型:学位论文
【摘要】:成牙本质细胞是位于牙髓组织最外层的高柱状细胞,顶端能够分泌牙本质基质,底端位于牙髓组织内,是一种典型的极性化细胞。在成牙本质细胞的发生过程中,经历了从无极性化细胞分化发育成为极性化细胞的过程。该过程的进行同时也伴随着成牙本质细胞的成熟与牙本质基质的分泌。在细胞顶底极性建立过程中,细胞连接的形成和极性蛋白复合物的定位是两个必要的细胞生物学行为。细胞连接作为相邻细胞间的锚定结构,起到阻隔外来物质通透细胞层的作用,同时作为细胞膜分隔条带,将细胞膜区域分为顶端和底端。细胞连接的建立也为细胞极性复合物在细胞膜上的定位提供了锚定结构,是细胞极性形成的前提。细胞极性复合物的发生及其在细胞膜特定区域的定位则是细胞极性形成的分子基础。极性分子在细胞膜的定位决定了细胞膜相应区域的功能。同时,,细胞连接的建立和极性分子的定位也可以影响细胞器在胞浆内的分布。发育成熟的成牙本质细胞,其细胞核位于细胞的底端,内质网、高尔基体等细胞器则朝向细胞的分泌端,即细胞顶端。这种细胞形态的形成正是其细胞极性化分泌功能的形态学基础。本课题采用多种分子生物学方法证实了与成牙本质细胞极性建立密切相关的部分蛋白的表达,并对其功能进行了初步探讨,以期为相关研究提供一定的基础。 1.成牙本质细胞部分极性蛋白的表达 提取小鼠牙髓组织和OLCs细胞的总RNA和总蛋白后,用PCR检测cdc42、ZO-1、occludin、claudin-1、E-cadherin mRNA的表达,用western blot检测cdc42蛋白的表达。OLCs细胞经固定、脱水、通透后,用细胞免疫荧光检测cdc42在OLCs中的表达定位。出生后2周小鼠及出生前14天、16天、18天胚胎小鼠经固定、脱水、浸蜡、包埋、切片后,用组织免疫荧光检测cdc42在牙胚发育过程中的表达。结果显示,cdc42、ZO-1、occludin、claudin-1、E-cadherin mRNA及cdc42蛋白在牙髓组织和OLCs中皆有表达。在OLCs细胞膜和细胞浆中,cdc42皆有表达并且在细胞核周围表达量明显高于其他部位。在牙胚发育过程中,cdc42参与了成牙本质细胞极性化的发生过程。 2.成牙本质细胞细胞连接的体外建立及其与LPS的关系 OLCs接种于含有α-MEM培养液的transwell小室中培养两周后,通过扫描电镜观察细胞排列状态,通过透射电镜观察细胞间连接的建立。OLCs接种于6孔板中,各组培养液中加入不同浓度LPS(10ng/ml、100ng/ml、和1000ng/ml),以条件培养液(10ng/ml LPS)中同时加入NF-κB抑制剂PDTC和LPS组作为对照;分别培养0.5h、1h、2h、6h,各时间点采用Western blot观察细胞连接蛋白E-cadherin在蛋白水平的变化;以实时定量PCR观察细胞连接蛋白ZO-1、occludin、claudin-1和E-cadherin在mRNA水平的改变。结果显示,经过立体培养的OLCs细胞间形成了明显的细胞连接。经过LPS处理后,ZO-1、occludin、claudin-1和E-cadherin的mRNA表达水平明显降低,且在一定的作用时间范围内呈明显的时间依赖性,但与浓度(10-1000ng/ml)无明显依赖性。同时,E-cadherin在蛋白水平随着LPS作用时间的延长其表达水平逐渐降低,而NF-κB抑制剂PDTC时能够抑制这种效应。 3.cdc42与牙源性细胞矿化的关系 OLCs细胞接种培养至融合80%后,实验组分别更换为矿化诱导液、含10ng/mlLPS的α-MEM培养液和含10ng/ml LPS矿化诱导液经一定时间培养后,通过westernblot测定其中cdc42含量的变化;矿化诱导液组和含ML141的矿化诱导液组培养一定时间后,通过茜素红染色观察矿化结节形成情况并进行定量分析。HDPSCs在含不同浓度LPS的矿化诱导液和含不同浓度ML141的矿化诱导液中培养一定时间后,通过茜素红染色观察矿化结节形成并定量分析。Western blot结果显示,OLCs中cdc42的表达在矿化诱导液的作用下未发生明显改变,在LPS作用下明显上调。茜素红染色结果显示,OLCs矿化结节的形成量与时间正相关,与ML141的浓度呈负相关;HDPSCs矿化结节的形成与LPS浓度正相关,与ML141浓度负相关。
[Abstract]:Odontoblasts are tall columnar cells in the pulp tissue of the outermost layer top can secrete dentin matrix, the bottom end is located in the pulp, is a typical polar cell. In the event of the odontoblast process, experienced from the polarity of cell differentiation and development process become polarized cells. That process was accompanied by a secreted mature odontoblasts and dentin matrix. At the top of the bottom cell in the process of the establishment, positioning and formation of cell junctions and polarity protein complexes are two essential cell biology. Cell junctions between adjacent cells as the anchor structure to isolate a foreign substance, transparent cell layer, and at the same time as the cell membrane separating strip, the membrane area is divided into the top and bottom. The connection for the establishment of cell cell polarity complexes located on the cell membrane provided The anchor structure is a prerequisite for cell polarity formation. Cell polarity complexes and its localization in the cell membrane in specific regions is the molecular basis of cell polarity formation. The positioning of polar molecules in the cell membrane determines the corresponding membrane area function. At the same time, the establishment of cell connection and positioning the molecule can also influence the distribution of the cytoplasmic organelles. Development of odontoblast cells into mature cells, the nucleus is located at the bottom of the endoplasmic reticulum and Golgi bodies toward the end of the secretion of cells, i.e. cells. This cell apical shape is the morphology of cell polarity the basic secretion function. This issue using a variety of molecular biology methods confirmed the expression of some proteins closely related to odontoblast cell polarity establishment, and its function are discussed, in order to provide some related research Basics.
Expression of partial polar protein in 1. odontoblast cells
Total RNA was extracted from mouse dental pulp tissue and OLCs cells and the total protein detected by PCR, Cdc42, ZO-1, occludin, claudin-1, E-cadherin mRNA expression, Cdc42 protein expression in.OLCs cells by detection of Western blot by fixed, dehydrated, transparent, with immunofluorescence detection of Cdc42 expression in OLCs after birth location. 2 and 14 days before the birth of Zhou Xiaoshu, 16 days, 18 days of embryonic mice after fixation, dehydration, paraffin embedding, slicing, immunohistochemistry, expression of Cdc42 during tooth development. The results showed that Cdc42, ZO-1, occludin, claudin-1, E-cadherin mRNA and Cdc42 protein in dental pulp and OLCs is expressed in OLCs cell membrane and cytoplasm, Cdc42 is expressed and the expression level was significantly higher than that of other parts in the vicinity of the nucleus. During tooth development, Cdc42 is involved in the generation process of dentin cell polarity.
Establishment of 2. odontoblast cell connection in vitro and its relationship with LPS
OLCs inoculated in -MEM culture liquid containing alpha Transwell cells in culture after two weeks, by using scanning electron microscope arrangement of cells observed through transmission electron microscope, the connection between the establishment of.OLCs were inoculated in 6 well plates, with different concentrations of LPS in liquid culture groups (10ng/ml, 100ng/ml, and 1000ng/ml), with conditioned medium (10ng/ml LPS) in both NF- and B inhibitors PDTC and LPS as the control group were cultured in 0.5h, 1H; 2h, 6h, changes in each time point using Western blot to observe cell junction protein E-cadherin in protein level; real-time quantitative PCR to observe cell junction proteins ZO-1, occludin, claudin-1 and E-cadherin at mRNA level. The results showed that after three-dimensional cultured OLCs cells formed obvious cell connection. After treatment by LPS, ZO-1, occludin, claudin-1 and E-cadherin mRNA expression level significantly decreased, and in the There was a significant time dependence in time range, but no significant dependence on concentration (10-1000ng/ml). At the same time, E-cadherin level decreased with the prolongation of LPS action time, while NF- kappa B inhibitor could inhibit this effect.
Relationship between 3.cdc42 and odontogenic cell mineralization
OLCs cells were cultured to confluence after 80%, the experimental group were replaced with mineralized induced liquid, alpha -MEM containing 10ng/mlLPS culture medium and culture medium induced by a certain period of time with 10ng/ml LPS after mineralization, determined the change of Cdc42 content by Westernblot; mineralization induced group and ML141 induced group mineralization after cultured for a certain time, the formation and quantitative analysis by.HDPSCs and ML141 in solution containing different concentration with different LPS concentrations of mineralized induced liquid in a certain period of training by alizarin red staining of mineralized nodules after alizarin red staining was used to observe the formation of mineralized nodules and the quantitative analysis of.Western blot showed that the expression of OLCs Cdc42 in mineralized induced liquid under the action of not changed significantly in the presence of LPS was obviously up-regulated. Alizarin red staining showed that OLCs mineralized nodule formation was related to quantity and time, and ML141 The concentration was negatively correlated, and the formation of HDPSCs mineralized nodules was positively related to the concentration of LPS, and was negatively correlated with the concentration of ML141.
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:R781.3
【相似文献】
相关期刊论文 前10条
1 崔春,陈智;基膜及其相关分子在成牙本质细胞分化中的作用[J];国外医学.口腔医学分册;2004年01期
2 宋玮,赵守亮,石勇,何文喜;人成牙本质细胞的分离和鉴定[J];牙体牙髓牙周病学杂志;2005年02期
3 吴礼安;文玲英;杨富生;王小竞;;尼古丁抑制成牙本质细胞增殖及作用机制的研究[J];华西口腔医学杂志;2008年02期
4 何文喜,牛忠英,赵守亮;骨形成蛋白信号转导与成牙本质细胞分化[J];北京口腔医学;2001年03期
5 何文喜,刘晓爱;转化生长因子β信号转导与成牙本质细胞分化[J];牙体牙髓牙周病学杂志;2002年01期
6 王捍国,肖明振,赵守亮,郝建军;人成牙本质细胞样细胞的原代培养[J];牙体牙髓牙周病学杂志;2002年02期
7 吴礼安,文玲英,杨富生,刘勇;成牙本质细胞中上游刺激因子1表达的原位杂交研究[J];上海口腔医学;2003年02期
8 余擎;成牙本质细胞分化的分子机制[J];牙体牙髓牙周病学杂志;2003年02期
9 戈迎迎,翁雨来;成牙本质细胞的基本特征及其研究进展[J];上海口腔医学;2004年03期
10 王效英,张旗,陈智;永生化成牙本质细胞样细胞系研究进展[J];国外医学.口腔医学分册;2004年05期
相关会议论文 前10条
1 田卫东;谢家敏;刘磊;汤炜;郑晓辉;李声伟;;人类牙乳头间充质细胞向成牙本质细胞定向诱导分化的实验研究[A];2007年第七次全国牙体牙髓病学学术会议论文集[C];2007年
2 郝玉庆;王国荃;刘开泰;;过量氟对培养人牙乳头间充质细胞合成分泌Ⅰ型胶原的影响[A];新世纪预防医学面临的挑战——中华预防医学会首届学术年会论文摘要集[C];2002年
3 王晓春;梁景平;李昊妍;张秀丽;宋爱梅;陈颖;郭炳诗;;成人成牙本质细胞原位培养模型的建立[A];2007年第七次全国牙体牙髓病学学术会议论文集[C];2007年
4 谢家敏;田卫东;陈希哲;郑晓辉;汤炜;刘磊;;体外诱导人牙乳头间充质细胞向成牙本质细胞样细胞分化[A];2004年中国口腔颌面修复重建外科学术会议论文汇编[C];2004年
5 吕海鹏;史俊南;赵守亮;Athony J.Smith;;人成牙本质细胞样细胞L型钙离子通道α1亚基D亚型特异性基因的表达、纯化和多克隆抗体的制备[A];全国第八次牙体牙髓病学学术会议论文汇编[C];2011年
6 吕海鹏;史俊南;赵守亮;Athony J.Smith;;人成牙本质细胞样细胞L型钙离子通道α_1亚基D亚型特异性基因的表达、纯化和多克隆抗体的制备[A];2007年第七次全国牙体牙髓病学学术会议论文集[C];2007年
7 杨国斌;袁国华;陈硕;;BMP2调控DSPP基因转录由DLX3/OSX信号通路介导[A];全国第八次牙体牙髓病学学术会议论文汇编[C];2011年
8 李玉成;于金华;史俊南;金岩;;利用结合有TGF-β1的微孔滤膜离体诱导成牙本质细胞分化的研究[A];2007年第七次全国牙体牙髓病学学术会议论文集[C];2007年
9 吕海鹏;赵守亮;史俊南;Athony J.Smith;;人成牙本质细胞L型钙离子通道α1亚基D亚型特异性基因的原核表达质粒的构建和鉴定[A];全国第三次牙体牙髓病学临床技术研讨会论文汇编[C];2009年
10 李适廷;姚乃晖;余擎;孔辉;朱庆林;倪龙兴;;Runx2调控小鼠成牙本质细胞分化以及牙本质形成的研究[A];全国第八次牙体牙髓病学学术会议论文汇编[C];2011年
相关博士学位论文 前10条
1 王捍国;永生化人成牙本质细胞样细胞系的建立及其生物学和功能学特征分析[D];第四军医大学;2002年
2 张光东;大鼠颌突外胚间充质干细胞向成牙本质细胞样细胞的定向诱导分化[D];中国人民解放军第四军医大学;2003年
3 姜永;成纤维细胞生长因子18对成牙本质细胞分化的作用及信号传导通路的研究[D];第四军医大学;2006年
4 李鹏;新型机械敏感离子通道Piezo在成牙本质细胞表达和功能研究[D];第四军医大学;2013年
5 李霞;TRAF6对成牙本质细胞功能的调控作用的研究[D];第四军医大学;2005年
6 黄欣;成牙本质细胞分化中microRNA靶向调控牙本质涎磷蛋白基因的研究[D];南方医科大学;2011年
7 王锋;BMP2调控成牙本质细胞分化经由Dlx3-Osx-GCN5信号通路介导[D];福建医科大学;2014年
8 陈新梅;甲状旁腺激素对牙乳头间充质细胞、组织影响的实验研究[D];第四军医大学;1998年
9 李玉成;组织工程化牙根组织的研究[D];第四军医大学;2007年
10 李适廷;Runx2调控小鼠成牙本质细胞与成釉细胞的分化以及牙齿矿化的研究[D];第四军医大学;2011年
相关硕士学位论文 前10条
1 吴煜;过量氟对大鼠牙髓成牙本质细胞超微结构的影响及免疫组化的研究[D];广西医科大学;2005年
2 宋玮;人成牙本质细胞的分离和鉴定[D];第四军医大学;2005年
3 李娜;纳米羟基磷灰石颗粒尺度及浓度对成牙本质细胞增殖和成矿的影响[D];浙江大学;2012年
4 李鹏;氟化物诱导成牙本质细胞凋亡的相关研究[D];第四军医大学;2010年
5 段晴月;骨髓间充质干细胞分化为成牙本质细胞的体内研究[D];第四军医大学;2010年
6 安倩;Calbindin-D28k与肌动蛋白在牙胚、牙髓组织中的分布及相互关系的实验研究[D];第四军医大学;2002年
7 胡楠;TLR9信号途径在成牙本质细胞中作用的研究[D];第四军医大学;2010年
8 赵颖煊;人成牙本质细胞L型钙离子通道α_1亚基D亚型特异性基因的克隆研究[D];第四军医大学;2008年
9 车兆畅;L型钙离子通道对成牙本质细胞内钙影响的实验研究[D];第四军医大学;2002年
10 张淳;不同龋深状态下人成牙本质细胞的凋亡及凋亡蛋白Bcl-2,Bax的表达[D];河北医科大学;2013年
本文编号:1483428
本文链接:https://www.wllwen.com/yixuelunwen/kouq/1483428.html