MiR-218-5p通过CD44-ROCK通路抑制口腔鳞癌细胞侵袭

发布时间：2018-02-07 13:04

本文关键词： 口腔鳞状细胞癌侵袭 mi-218-5p CD44 微流控芯片　出处：《大连医科大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：口腔鳞状细胞癌(Oral squamous cell carcinoma,OSCC)是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤,在我国OSCC的发病率约在3.6/10万-8.0/10万人之间。OSCC具有较早的淋巴结转移的倾向,晚期可转移至肺、肝、骨等器官,其五年生存率为50%左右。研究认为发生转移的肿瘤细胞常位于侵袭前沿(Invasive front),与位于肿瘤主体的细胞相比,侵袭前沿的细胞具有更强的侵袭能力,许多导致肿瘤侵袭的分子事件比如蛋白水解酶的分泌、细胞增殖活性的增加、血管新生、细胞间黏附分子的改变等均在侵袭前沿被发现。因此,辨别并筛选出侵袭前沿细胞亚群可以使我们更深入地解析肿瘤侵袭和转移的分子机制,发现抑制肿瘤转移的新靶点。在OSCC侵袭前沿研究方面,以往研究多局限于利用免疫组织化学染色方法分析侵袭前沿细胞上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)标志物的表达,难以分离获得这些位于侵袭前沿的癌细胞,无法对其进行深入的分析。因此,在体外模拟OSCC组织在体内的侵袭状况,分离获得侵袭前沿的癌细胞是解决这一问题的有效途径。微流控芯片是一种在微米尺度的空间对流体进行操控为主要特征的科学技术,与传统技术相比较微流控技术是对哺乳动物细胞及其微环境进行操控的理想平台,它消耗低、通量高、仿生性强,在一定程度上可以取代动物模型。本研究以微流控芯片为平台分离获得了侵袭前沿的OSCC细胞,并深入分析了促进OSCC细胞侵袭性增强的分子机制。遗传和表观遗传因素均可调控肿瘤细胞的侵袭性,最近研究发现微小RNA(micro RNA,mi RNA)可以在表观遗传水平调控肿瘤侵袭。然而,mi RNA在OSCC侵袭前沿细胞的表达状况及其促进侵袭的机制目前尚未完全阐明。我们对在微流控芯片上分离获得的OSCC侵袭前沿细胞进行small RNA测序,揭示了mi RNA在侵袭前沿细胞的表达特点,并探究了其调控分子信号通路,为阐明OSCC的侵袭侵袭机制提供一种新的视点。目的:以微流控芯片为平台分离获得OSCC侵袭前沿细胞,从表观遗传水平探讨OSCC侵袭性增强的分子机制。方法:本研究采用的OSCC细胞株为UM-SCC6,采用本实验室构建的微流控芯片及其操作方法分离获得UM-SCC6侵袭前沿细胞。具体操作如下:在微流控芯片上利用基质胶通道分隔细胞培养通道和刺激诱导通道,将UM-SCC6接种在细胞培养通道,采用无血清培养基培养,在刺激诱导通道加入20%血清的细胞培养液,诱导UM-SCC6细胞的侵袭,将侵袭通过基质胶通道迁移至刺激诱导通道的细胞采用胰蛋白酶消化后,移到培养皿中扩大培养。上述诱导步骤连续重复3次,最终获得UM-SCC6侵袭前沿细胞。采用划痕实验考察细胞迁移能力;采用微流控芯片和Transwell小室考察细胞侵袭能力;采用细胞免疫荧光染色和Western blot检测EMT经典标志物的表达,如E-钙粘蛋白(Epithelial cadherin,E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin,Vim)和神经钙粘蛋白(Neural cadherin,N-cadherin);CCK8增殖实验考察细胞的增殖能力。采用Trizol法提取UM-SCC6-M和UM-SCC6的总RNA,送至Novogene公司进行测序建库和质量控制,进行small RNA测序分析。在对获得的数据质量进行基本分析后,对比UM-SCC6和UM-SCC6-M的差异表达mi RNAs,通过mi Randa对获得的mi RNAs的靶基因进行预测,并行KEGG富集分析。采用realtime PCR分析mi RNA的表达;采用western blot检测蛋白表达;利用mimic和inhibitor的转染研究mi RNA的功能,利用Western blot和荧光素酶报告系统确定mi RNA对CD44的调控作用和直接结合。利用ROCK蛋白的抑制剂Y27632来检测mi R-218-5p对细胞侵袭的调控作用与CD44-ROCK通路的关系。结果:基于微流控芯片的细胞培养、诱导、分离,我们获得了UM-SCC6侵袭前沿细胞,命名为UM-SCC6-M。不同于UM-SCC6的“铺路石”样,UM-SCC-M细胞之间连接较为松散,部分细胞形态呈类似成纤维细胞的细长形,有的具有长长的“伪足”,有的细胞呈“多角形”,形态学上UM-SCC6-M具有间质细胞的特点。划痕实验显示UM-SCC6-M具有比UM-SCC6强的迁移能力。在侵袭前沿微流控芯片体外模型中,经过24、48、72和96小时的血清诱导,UM-SCC6-M侵袭入基质胶中的高度和面积比UM-SCC6显著增加。Transwell侵袭实验显示UM-SCC6-M侵袭过Matrigel胶膜的细胞数目明显增多。免疫荧光染色和Western blot表明E-cadherin蛋白水平在UM-SCC6-M显著降低,而Vim和N-cadherin则显著增高。CCK8增殖实验显示UM-SCC6-M的增殖能力与UM-SCC6相比较没有显著变化。因此,我们分离获得了OSCC侵袭前沿细胞UM-SCC6-M,并证明其具有间质细胞的特点和较强的侵袭能力。通过small RNA测序及分析,我们获得了44个UM-SCC6和UM-SCC6-M表达差异的mi RNA,其中27个在UM-SCC6-M中表达降低。我们对mi RNAs靶基因的富集通路进行KEGG富集,发现这些mi RNA调控许多肿瘤相关信号通路,最为显著的是癌症蛋白多糖(Proteoglycans in cancer)信号通路。因此,我们将研究重点放到了影响肿瘤转移的CD44信号通路。Realtime PCR实验结果显示CD44的m RNA在UM-SCC6-M中的表达水平与UM-SCC6相似,western blot结果显示CD44蛋白在UM-SCC6-M中的表达水平高于UM-SCC6,提示mi RNA可能调控了CD44在UM-SCC6-M中的表达。Small RNA测序结果显示mi R-218-5p在UM-SCC6-M的表达水平下降,realtime PCR实验结果与测序结果一致。通过mi Randa预测网站预测mi R-218-5p在CD44的m RNA上有结合位点,荧光素酶报告系统实验确认了mi R-218-5p对CD44的m RNA的3’UTR区域的直接结合和调控作用,提示mi R-218-5p调控的CD44表达可能在OSCC侵袭中发挥一定的作用。我们采用mi R-218-5p的mimic和inhibitor干扰mi R-218-5p的表达水平,Western blot显示mi R-218-5p的mimic和inhibitor可以影响CD44蛋白的表达,基于微流控芯片和Transwell的侵袭实验均显示mi R-218-5p的mimic显著抑制UM-SCC6-M的侵袭,而mi R-218-5p的inhibitor则显著促进UM-SCC6的侵袭能力,同时mi R-218-5p的inhibitor的促侵袭作用可被CD44下游蛋白ROCK的inhibitor逆转,证明了mi R-218-5p可以调控CD44-ROCK信号通路。结论:我们发展了一种基于微流控芯片分离OSCC侵袭前沿细胞的方法,分离获得了具有部分间质细胞表型的OSCC细胞(UM-SCC6-M)。通过对UM-SCC6-M的深入研究,我们发现mi R-218-5p在侵袭前沿细胞表达下调,导致CD44-ROCK信号通路激活,从而侵袭性增强。ROCK抑制剂具有逆转mi R-218-5p在侵袭前沿细胞下调导致侵袭性增强的效果。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R739.8

【相似文献】