自酸蚀粘接剂作为ACP纳米前驱体的载体提供仿生再矿化的研究

发布时间：2018-03-01 09:10

本文关键词： 仿生再矿化胶原纤维自酸蚀粘接剂牙本质无定形磷酸钙　出处：《浙江大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分无定形磷酸钙(ACP)的制备及其对Ⅰ型胶原的仿生再矿化研究目的:合成含硅并用聚天冬氨酸(PAsp)稳定的ACP颗粒(PAsp-Si-ACP),评价其对重组Ⅰ型胶原及脱矿牙本质的再矿化性能,并检测其生物安全性。材料与方法:采用溶液沉淀法制备含硅并用聚天冬氨酸稳定的ACP颗粒(PAsp-Si-ACP)和聚天冬氨酸稳定的ACP颗粒(PAsp-ACP)。将10 ml的10 mM/L CaCl2 和 480 μg/L PAsp 的混合液与等体积的 6 mM/L Na2HPO4 和 12 mM/L Na2SiO3·9H2O的混合液混合反应10分钟,离心,在30℃真空干燥箱内过夜,制得PAsp-Si-ACP颗粒。将10 ml的10 mM/L CaCl2和480μg/L PAsp的混合液与等体积的6 mM/L Na2HP04混合反应10分钟,离心,真空干燥箱内过夜,制得PAsp-ACP颗粒。采用透射电镜(TEM)、扫描电镜(SEM)、X射线光电子能谱(XPS)、傅里叶红外分析(FTIR)、X射线衍射(XRD)等方法进行表征。实验分为对照组(PAsp-ACP)和实验组(PAsp-Si-ACP),采用单层重组胶原模型,评价ACP颗粒对Ⅰ型胶原的再矿化能力。将来源于鼠尾的Ⅰ型胶原溶液组装在400目的透射电镜镍网上,制备24个附有重组胶原的TEM镍网。(1)对照组:将8mg的PAsp-ACP颗粒溶解在240μl的1M HEPES液(pH=7.4)中,超声混匀,滴在培养皿中形成一个小液滴状,制备3个小液滴;(2)实验组:将8mg的PAsp-Si-ACP颗粒溶解在240μ1的1MHEPES液(pH=7.4)中,超声混匀,滴在培养皿中形成一个小液滴状,制备3个小液滴。将4个附有重组胶原的TEM镍网漂浮在一个小液滴上,在37℃C恒温箱内矿化1、4、7天后取出,每组每个时间点取4个样本。制备6个大小约3 mm×3mm×1 mm的人牙本质片,采用37%磷酸酸蚀30 s制备脱矿牙本质片,随机选取2个样本用于TEM观察牙本质脱矿后的超微结构,余4个用于PAsp-Si-ACP颗粒对脱矿牙本质再矿化的实验。将33.3 mg的PAsp-Si-ACP颗粒分散在1 ml的1M HEPES液(pH=7.4)中,将牙片放入混合液中,1月后取出。样本均采用透射电镜(TEM)观察晶体在胶原内沉积的情况,同时采用选区电子衍射(SAED)观察晶相情况。采用CCK-8法检测PAsp-Si-ACP颗粒的细胞毒性。结果:透射电镜和扫描电镜显示所合成的PAsp-Si-ACP及PAsp-ACP颗粒为圆球形,大小约为20-80nm。傅里叶红外及XRD分析显示所合成的ACP颗粒为无定形相。XPS检测示PAsp-Si-ACP的组成元素含有Ca、P、O、Si、N、C,PAsp-ACP的组成元素为Ca、P、O、N、C。TEM显示实验组PAsp-Si-ACP中,1天的样本中Ⅰ型胶原纤维大部分矿化,4天和7天的样本中Ⅰ型胶原几乎全部矿化,呈纤维内和纤维外矿化。而对照组PAsp-ACP中,1天和4天的样本中,胶原未矿化,7天的样本中,Ⅰ型胶原仅出现少量的矿化。SAED提示羟基磷灰石沿着胶原纤维的长轴有序地排列,为结晶相。TEM显示牙本质用37%磷酸酸蚀30 s后形成一个10-15 μm的脱矿层。脱矿牙本质再矿化1个月,TEM显示脱矿牙本质出现再矿化,再矿化层约3-5μm厚。CCK-8显示所合成的PAsp-Si-ACP颗粒具有良好的生物相容性。结论:PAsp-Si-ACP颗粒对Ⅰ型胶原具有良好的矿化性能,Si对Ⅰ型胶原的矿化具有促进作用。PAsp-Si-ACP颗粒具有良好的生物相容性,为临床上的应用奠定了基础。第二部分自酸蚀粘接剂作为ACP纳米前驱体的载体对单层重组Ⅰ型胶原的仿生再矿化研究目的:采用单层重组胶原模型,探讨自酸蚀粘接剂作为ACP纳米前驱体(固态PAsp-Si-ACP颗粒)的载体对重组Ⅰ型胶原的矿化性能。材料与方法:PAsp-Si-ACP的合成方法及单层Ⅰ型胶原重组方法同实验一。选用两种自酸蚀粘接剂Clearfil S3 Bond(可乐丽公司,日本)和Adper Easy one(3M,美国)作为载体,根据有无添加PAsp-Si-ACP颗粒分为实验组和对照组。实验组:在两种粘接剂中分别添加5wt%,15wt%,25wt%的PAsp-Si-ACP颗粒,搅拌均匀,制备成直径约13mm,厚度为0.1mm的矿化薄膜,光照80s(Radii plus,1500mW/cm2,SDI,澳大利亚),固化。对照组:以粘接剂作为空白对照组,制备成直径约13 mm,厚度为0.1 mm的粘接剂薄膜,光照80s,固化。将矿化薄膜和粘接剂薄膜平放在12孔板底部内,薄膜上方滴上240μl人工唾液。将128个附有重组胶原的TEM镍网(n=16个)漂浮在人工唾液上,每个孔内漂浮4个TEM镍网,在37℃C恒温箱内矿化1、4、7、14天后取出,每组每个时间点取4个样品。用透射电镜(TEM)和选区电子衍射(SAED))观察。采用电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)测定所筛选出的对胶原具有矿化潜能的矿化薄膜在133 mmol/LNaCl、50 mmol/L HEPES、pH =7.4溶液中28天内的钙磷释放量。结果:对照组和添加5wt%和15wt%PAsp-Si-ACP的实验组的样本中胶原未见明显矿化。添加25wt%PAsp-Si-ACP的实验组中发现第4天的样本中胶原部分矿化,选区电子衍射(SAED)显示仍为无定形相。在第7天的时候胶原出现部分矿化,矿化区和非矿化区有明显的界限。在14天的时候,胶原几乎全部矿化。选区电子衍射呈现002晶面,提示晶体沿着胶原纤维的长轴排列。添加25wt%PAsp-Si-ACP的矿化薄膜在28天内具有持续稳定的钙磷释放量。结论:在自酸蚀粘接剂中添加25wt%PAsp-Si-ACP颗粒,对重组Ⅰ型胶原具有矿化能力,而且在28天内具有持续稳定的钙磷释放量。自酸蚀粘接剂可以作为ACP纳米前驱体(固态PAsp-Si-ACP颗粒)的载体提供仿生再矿化。第三部分自酸蚀粘接剂作为ACP纳米前驱体的载体对脱矿牙本质的仿生再矿化研究目的:探讨自酸蚀粘接剂作为ACP纳米前驱体(固态PAsp-Si-ACP颗粒)的载体对脱矿牙本质的矿化性能。材料与方法:PAsp-Si-ACP合成方法和脱矿牙本质的制备方法同实验一。制备48个脱矿牙本质片,随机分成以下4组(n=12):(1)对照组(S3):Clearfil S3 Bond;(2)对照组(AEO):Adper Easy One;(3)实验组(S3+25wt%PAsp-Si-ACP):在 Clearfil S3 Bond 粘接剂中加入25wt%PAsp-Si-ACP颗粒,充分混匀,避光保存;(4)实验组(八EO+25wt%PAsP-Si-ACP):在Adper Easy One粘接剂中加入25wt%PAsp-Si-ACP颗粒,充分混匀,避光保存。对照组(组1和组2)严格按照厂家说明,将粘接剂涂在脱矿牙本质片表面,光照固化后,在粘接剂表面再覆盖一薄层流动树脂。实验组(组3和组4),将添加有PAsp-Si-ACP的粘接剂涂于脱矿牙本质表面后,涂擦20 s,轻吹5 s,光照10 s,在粘接剂表面再覆盖一薄层流动树脂。将制备好的样本放入人工唾液中(15ml/个),放在在37℃C的恒温水浴培养箱内,人工唾液每周更换。待1天、1月、3月后取出样本,每组每个时间点取4个样本,用透射电镜(TEM)和选区电子衍射(SAED)观察。结果:透射电镜显示对照组(组1和组2)中1天、1月和3月的样本中脱矿牙本质没有出现再矿化。在实验组(组3:S3+25wt%PAsp-Si-ACP)中,1天的样本在脱矿层底部出现约200-300 nm的再矿化层,SAED显示为微弱的晶相结构。在实验组(组4:AEO+25wt%PAsp-Si-ACP)中,在1天的样本中,脱矿层底部未出现再矿化层。但在两组实验组的1个月和3个月的样本中,脱矿层底部都分别出现1.5μm和2 μm的再矿化层。SAED显示为羟基磷灰石晶相结构。结论:含25wt%PAsp-Si-ACP的自酸蚀粘接剂可以使脱矿牙本质再矿化。自酸蚀粘接剂可以作为ACP纳米前驱体(固态PAsp-Si-ACP颗粒)的载体提供仿生再矿化。
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【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R783.1

【参考文献】