面神经缺损修复及神经周瘢痕预防的相关研究

发布时间：2018-03-12 19:25

本文选题：面神经　切入点：脱细胞神经　出处：《中国人民解放军医学院》2014年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分、壳聚糖导管预防周围神经瘢痕的实验研究实验一壳聚糖导管预防兔面神经周瘢痕的实验研究目的：周围神经解剖性损伤后，神经周瘢痕的形成会压迫神经，阻碍轴突的再生，影响神经功能的恢复。应用可生物降解的壳聚糖导管作为物理屏障，观察其对兔面神经周瘢痕及神经内血运的影响。方法：新西兰大白兔36只，行腮腺大部切除，面神经解剖性损伤造模。随机分为覆盖组、包裹组、自体对照组。于术后4、12周采用Petersen分级评估面神经与周围组织粘连情况，采用组织学染色方法检测面神经周瘢痕及神经内血管密度，并采用触须运动、透射电镜、神经电生理等方法对面神经功能进行评估。结果：术后4周时petersen评分无明显差异（P0.05），12周时瘢痕粘连较明显，覆盖组与包裹组解剖时较自体对照组容易（P0.01）；术后4周覆盖组有髓神经纤维直径、髓鞘厚度、神经纤维数量均优于包裹组及对照组，具有统计学意义（p0.05）；术后4、12周对照组胶原厚度大于覆盖组与包裹组，差异有统计学意义（P0.01）；术后12周覆盖组与自体对照组两者纤维直径较接近，排列均整齐，髓鞘壁较厚，两组间无明显差异（P0.05），包裹组纤维直径、髓鞘壁厚度、神经内血管密度均较小，与前两者存在显著性差异，具有统计学意义（p0.05）。结论：壳聚糖导管作为物理屏障覆盖于面神经表面可有效减少神经周瘢痕的形成、减轻瘢痕对面神经功能的影响。实验二、壳聚糖导管复合透明质酸预防大鼠坐骨神经瘢痕的实验研究目的：观察将壳聚糖导管与透明质酸联合应用对大鼠坐骨神经1cm钳夹性损伤后神经功能的影响。方法：选用清洁级健康成年SD大鼠60只，坐骨神经钳夹损伤造模，随机分为覆盖组、覆盖+透明质酸组、钳夹组、钳夹+透明质酸组，每组15只。于术后4、8、12周对坐骨神经与周围组织粘连、神经周瘢痕增生情况进行观察，并对神经功能进行坐骨神经功能指数、组织学和神经电生理检测。结果：术后4周时坐骨神经功能指数、petersen评分、神经纤维计数、髓鞘厚度、有髓神经纤维平均直径各组间均无明显差异；术后8周、12周时，钳夹+透明质酸组其坐骨神经功能指数、petersen评分、神经纤维计数、髓鞘厚度、有髓神经纤维平均直径等各项指标均优于对照组。术后4、8、12周时神经外膜胶原厚度检测各组均明显低于对照组，差异有统计学意义（p0.01），12周时HA组神经外膜胶原厚度要厚于壳聚糖组及壳聚糖+HA组，差异有统计学意义（p0.05）。结论：壳聚糖导管复合透明质酸可以促进鼠坐骨神经钳夹损伤的恢复，减少其神经周瘢痕的产生。实验三、壳聚糖导管植入对腮腺术后面神经功能恢复的临床效果观察目的：观察并比较壳聚糖导管应用于腮腺手术后对术后患者面神经功能恢复的影响。方法：75例腮腺肿瘤患者接受腮腺浅叶摘除术或腮腺全切手术，分为两组，一组应用壳聚糖导管覆盖面神经总干及各分支，一组为常规手术作为对照。在手术后7天、1月、3月、6月和9月分别进行超声检查和血常规检查并按HB标准观察面神经功能。结果：随访时间9月-50月，平均21.7月，75名患者中50名行腮腺浅叶摘除，25名行腮腺全切术，手术后不同时间的血常规检及超声查显示无论是应用壳聚糖组还对照组，患者均无异常，表明壳聚糖导管植入体内后不会引起不良反应。术后7天即刻面瘫发生率壳聚糖组（29/32，90.6%），对照组（39/43,90.7%）；永久性面瘫发生率面瘫发生率壳聚糖组（0/32，0%），对照组（2/43,4.7%）均无统计学差异（P0.05）。术后7天对两组患者面神经功能行HB评分，结果两组患者面神经麻痹严重程度无显著性差异（P0.05）。对患者面神经恢复速度进行检测，发现壳聚糖组神经恢复速度快于对照组，差异有显著性意义（P0.01）。结论：壳聚糖导管具有良好的生物相容性，植入体内无不良反应，在腮腺手术后应用壳聚糖导管覆盖面神经对其功能恢复有一定促进作用。第二部分GDNF基因慢病毒载体的构建、病毒的包装及MSCs细胞的转染目的：构建携带EGFP和GDNF的慢病毒载体，利用其转染MSCs并对其进行鉴定，，获得可稳定过表达GDNF的MSCs。方法：通过PCR扩增，BamHI和AscI双酶酶切目的基因片段， T4DNA连接酶连接,将目的基因GDNF插入慢病毒载体pLenti6.3_MCS_IRES2-EGFP,构建重组慢病毒。在lipofectamine2000介导下将构建成功的慢病毒转染人胚肾细胞系(293T)，包装生产慢病毒,并测定病毒滴度。将包装好的慢病毒感染BMSCs,并对转染的细胞行病毒转染复数（MOI值）测定，筛选最佳感染复数。Western、RT-PCR分别检测转然后GDNF蛋白和mRNA的表达情况，流式细胞仪观察转染效率。结果：成功构建携带EGFP和GDNF的慢病毒，慢病毒转染MSCs后96小时强荧光表达，当MOI值为25时细胞荧光表达强且活性较好。Western和RT-PCR检测证实GDNF在MSCs中成功表达，流式细胞仪观察转染效率为94.2%。结论：成功将携带EGFP和GDNF的慢病毒转染MSCs，获得过表达GDNF基因的MSCs，为后期实验提供基础。第三部分、脱细胞神经复合GDNF转染的间充质干细胞修复兔面神经缺损的实验研究实验一、周围神经脱细胞方法的筛选目的：采用不同的方法对兔面神经进行脱细胞处理，对脱细胞神经组织学及体内植入进行检测，为面神经脱细胞方法的选择提供实验依据。方法：分别采用冻融法、化学法及冻融+酶消化法处理兔面神经，对处理的神经进行HE染色、扫描电镜观察和透射电镜观察其组织学结构；并将不同方法处理的神经进行兔背部皮下植入，于2、4周处死动物，行大体观察及组织学观察。结果：组织学观察见化学法（Hudson法）、冻融+酶消化法处理的神经其髓鞘清除较彻底，只有部分区域可见极少量髓鞘残留，冻融法处理的神经内可见髓鞘皱缩、变形但有较多残留。皮下埋植实验观察见单纯冻融法处理的神经内淋巴细胞浸润稍多，主要分布在神经束周边的基底膜间隙中，Hudson法、冻融+酶消化法处理的神经未见明显的炎性细胞浸润。结论：冻融+酶消化法处理方法简单、神经支架结构保存完整，神经内髓鞘等抗原成分去除较彻底，是一种良好的去细胞方法，为后期实验提供基础。实验二、脱细胞神经复合GDNF转染的MSCs修复兔面神经缺损目的：以脱细胞面神经为支架，复合GDNF转染的MSCs修复兔面神经多分支缺损，观察其对面神经再生及对面神经元存活的作用。方法：新西兰大白兔60只，面神经解剖性损伤造模。完全随机分为：脱细胞同种异体神经移植组（ANA），脱细胞异体神经+间充质干细胞组（AN-MSCs），脱细胞异体神经+GDNF转染的间充质干细胞（AN-G-MSCs），自体神经移植组（Control）。于术后4、12、24周时取材，对动物行大体观察并采用触须运动、神经电生理等方法对面神经功能进行评估，分别对移植神经的近端及远端行甲苯暗蓝染色、透射电镜观察其再生轴突的变化。结果：对面神经总干处神经轴突形态计量学分析发现，术后4周时脱细胞神经移植组其神经轴突计数、髓鞘厚度、髓鞘直径均明显低于其他三组，差异有统计学意义（P0.05）；术后12、24周时检测发现各组间无明显差异（P0.05）。面神经移植物远端术后12周时面神经各分支检测脱细胞神经移植与MSCs组神经轴突计数、髓鞘厚度、髓鞘直径均明显低于GDNF组与自体神经移植组，差异有统计学意义（P0.05）。术后24周时脱细胞神经移植各项指标均低于其他三组. 结论：将脱细胞神经与GDNF转染的MSCs联合应用可成功修复兔面神经多分支缺损，其修复效果优于单纯应用脱细胞神经，且可以一定程度上保护面神经元的存活。实验三同种异体神经移植修复面神经缺损的长期随访观察目的：临床应用脱细胞神经移植修复面神经缺损，并进行长期的随访，观察其修复效果及安全性。方法：2004年7月至2013年7月，因外伤或腮腺恶性肿瘤侵袭术中切除导致的面神经缺损44例，最终共有35例神经缺损修复患者完成随访观察，其中自体神经移植20例，脱细胞神经移植15例。术后最短随访时间为9个月，随访时分别进行局部超声检查和血常规检查，并按HB标准观察面神经功能。结果：随访时间9月-9年，面神经缺损长度10mm-50mm，其中术中一期缺损修复26例，二期手术移植9例，二期手术距损伤时间2天-3个月。术后随访时的血常规检及超声查均未发现无异常，表明脱细胞神经植入体内后未引起明显的不良反应。最终自体神经移植组与脱细胞神经移植组有意义的功能恢复分别为85%（17/20）和80%（12/15），无统计学差异（P0.05）；术后HB分级比较发现脱细胞神经移植神经功能恢复情况稍弱于自体神经移植，但差异无统计学意义（P0.05）。结论：采用脱细胞神经在临床上修复面神经缺损并进行长期的随访观察，结果发现脱细胞神经可以修复面神经缺损，长期随访未发现明显的不良反应，其修复与自体神经移植接近。脱细胞神经移植可成为临床面神经缺损修复的一种选择。
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【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R782.2

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