黄连素对骨髓间充质干细胞成骨分化作用的初步研究

发布时间：2018-03-15 09:01

本文选题：牙周组织再生　切入点：牙龈卟啉单胞菌　出处：《南京大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：牙周炎是由细菌感染导致的牙齿支持组织的慢性炎症性疾病。目前的治疗方法主要是机械清除菌斑和局部刺激因素,以及通过牙周再生性手术如GTR促进已破坏组织的恢复,但这些治疗方法只能停止疾病进展,组织再生疗效仍然十分有限。牙周组织工程是牙周组织再生的理想策略,其目标是在控制局部感染的基础上,使用支架材料、干细胞和细胞因子诱导牙周组织再生,以恢复牙周组织的结构和功能。考虑到感染和再生两个方面,负载抗生素/抗菌剂的组织工程支架是目前研究的焦点。传统抗生素具有毒副作用大、易产生耐药性等缺点,近来研究发现很多植物成分对人类病原微生物具有抗性,植物抗菌成分引起众人的关注,逐步成为研究的热点。黄连素(berberine,BBR)是一种苄基异喹啉生物碱,存在于白毛莨、黄连、刺檗、具芒小檗等植物的根茎中,它用于治疗腹泻已经有两千多年的历史,具有疗程短、疗效快、副作用少、作用温和、成本低等特点。最近研究发现黄连素对多种口腔致病菌具有抗菌作用。黄连浸提物以及黄连素对牙龈卟琳单胞菌(Porphyromonasgiingivalis,P.gingivlis)、伴放线放线杆菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans,A.actinomycetemcomitans)、中间普氏菌(Prevotella intermedia,P.intermedia)、变黑普氏菌(Preyotella nigrescens)、具核梭杆菌(Fusobacteriu.nucleatum,nucletum)等牙周致病菌具有较强的抑菌作用。将黄连药膜置于牙周袋,可明显减轻中重度牙周炎患者的牙龈炎症和探诊深度,提高基础治疗的疗效。此外,Ⅱ期临床试验证实口服黄连上清软胶囊可治疗上焦风热证,中医学中的上焦风热证即指急性牙周炎。黄连素在我国有着两千多年的药用历史,来源丰富,获取便利,安全经济,因此具有良好的临床应用前景。传统医学书籍《药品化义》中记录黄柏泡酒,和四物汤同服,有健骨的作用,可治疗膝盖疼痛和下肢无力。另外,用于治疗骨质疏松症的传统中草药配方如二仙汤含有黄连素,且其中的黄连素成分是抑制骨质疏松症的主要活性成分。动物实验和临床试验表明,黄连素单独使用或与维生素D3联合使用能有效缓解骨质疏松症,减少破骨细胞的数量,抑制破骨细胞的骨吸收活性,同时促进骨形成,提高骨形成相关因子的表达水平。黄连素在一定浓度范围内对骨髓巨噬细胞不产生细胞毒性,并通过抑制NF-κB和Akt的活化抑制破骨细胞的形成和活性。以上研究中,黄连素的骨保护作用主要与抑制破骨活动相关,关于黄连素促进干细胞成骨分化的研究很少。因此,本实验中我们研究了牙周关键致病菌P.gingvalis及其毒力因子牙龈素RgpA感染对骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨分化的影响,评价黄连素对P.gingivalis的抑菌作用,以及对P.gingivalis感染引起的成骨分化方面效应的调节,发现黄连素能够改善P.gingivalis感染引起的成骨分化能力下降,并进一步研究黄连素对BMSCs成骨分化的直接作用及可能的作用机制。将黄连素的广谱抗菌和促进干细胞成骨分化两方面的作用结合起来,有望用于牙周组织工程,在控制局部感染的同时,诱导干细胞的成骨分化潜能,提高牙周组织再生疗效。第一部分黄连素改善Pgingivalis 感染引起的间充质干细胞成骨分化能力下降[目的]细菌感染对牙周组织再生的成败具有关键性的影响。P.gingivalis是慢性牙周炎的关键致病菌,其毒力因子牙龈素(gingipain,GP)在促进牙周组织破坏过程中发挥着重要的作用。本部分初步探索P.ginnlis及RgpA(Arginine-gingipain A)突变菌感染对间充质干细胞成骨分化的影响,同时观察黄连素和CL(14-25)两种抗菌药物对P.gingivalis 感染引起效应的改善作用。[方法1首先采用overlap PCR的方法构建了同源重组片段up_erm_down',并将该片段连接到自杀质粒载体上,获得重组质粒pPHU281_up_erm_down,将重组片段或重组质粒电转化入P.gingivalis ATCC33277细胞,利用细菌DNA的同源重组构建RgpA突变菌。PCR、测序和SDS-PAGE鉴定RgpA突变菌。观察RgpA突变菌的菌落形成和血细胞凝集活性,透射电镜观察RgpA突变菌的结构组成,激光共聚焦显微镜观察RgpA突变菌的生物膜形成。CCK-8检测P.gingivalis和RgpA突变菌感染对间充质干细胞增殖活性的影响。qPCR检测间充质干细胞成骨分化相关基因的表达。微量肉汤稀释法检测黄连素和CL(14-25)对P.gingivalis的抑菌作用。提取并纯化细菌培养上清中的牙龈素蛋白,根据酶促反应的荧光产物释放量,检测黄连素和CL(14-25)对RgpA酶活性的抑制作用。[结果]成功构建了P.gingivalis ATCC33277 RgpA突变菌,与野生型菌相比,RgpA突变菌血细胞凝集活性下降、菌体胞外囊泡减少、细菌生物膜形成增加。感染复数MOI为100:1时,P.gingivaais及RgpA突变菌感染BMSCs 24h对细胞的增殖活性无明显影响,但引起Runx2、ALP、OCN等成骨分化相关基因的表达下降,P.gingivalis及RgpA突变菌感染对BMSCs成骨分化的影响无显著差异。黄连素和CL(14-25)两者均可抑制P.gingivalis 细菌的生长,且抑菌作用呈现药物浓度依赖性,其中黄连素最小抑菌浓度是31.3 μg/mL。黄连素和CL(14-25)均可抑制RgpA的酶活性,且酶活性抑制作用呈现药物浓度依赖性。黄连素显著改善P.gingvalis感染引起的间充质干细胞成骨分化基因下调,且与未感染对照组相比,进一步上调了 OSX、COLI、ALP、OCN、OPN等基因的表达。[结论]成功构建了RgpA 突变菌;在不影响细胞增殖活性的情况下,P.gingivalis感染引起BMSCs成骨分化基因表达下降,P.gingivalis毒力因子RgpA在此过程中作用不大;黄连素对P.gingivalis的抑菌作用显著优于CL(14-25);黄连素能够改善P.gingivalis感染引起的间充质干细胞成骨分化能力下降。第二部分黄连素对骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化能力的影响[目的]第一部分实验发现黄连素能够改善P.gingivalis 感染引起的干细胞成骨分化基因表达下降,本部分实验目的是研究黄连素对BMSCs成骨分化的直接作用。[方法]首先采用全骨髓贴壁法,分离大鼠BMSCs,做原代培养。观察细胞形态特征及生长情况,测定生长曲线,流式细胞仪检测CD90、CD105、CD45、CD11b等细胞表面标记。成骨诱导21天,茜素红染色检测成骨矿化能力;成脂诱导18天,油红O染色检测成脂分化能力。采用CCK-8法检测黄连素对大鼠BMSCs增殖活性的影响。成骨诱导培养基中加入0、1、3、10、30 μM黄连素,培养BMSCs 3天和7天后,碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase,ALP)活性检测试剂盒和染色分析观察ALP的表达;培养7、14天后,qPCR分别检测成骨分化相关因子(Runx2、OSX、COLI、ALP、OCN、OPN)的 mRNA表达水平;培养18天后,茜素红染色分析细胞矿化。[结果]分离获得的细胞具有贴壁特性;细胞表面CD90、CD105呈阳性表达,阳性率分别为99.5%、99.8%;CD45、CDllb表达阴性,表达率分别为4.67%、3.72%;具有多向分化潜能,在特定条件下可分化成成骨细胞和脂肪细胞。在2-32 μM浓度范围内黄连素对大鼠BMSCs没有细胞毒性。与对照组相比,黄连素浓度在1-10 μM时显著促进细胞ALP的活性,1、3μM时上调OSX、COLI、ALP、OCN、OPN等成骨相关基因的mRNA表达水平,促进矿化形成。黄连素促间充质干细胞成骨分化的最适浓度为3 μM。[结论]采用全骨髓贴壁法成功分离获得大鼠原代BMSCs。3μM黄连素显著促进BMSCs的成骨分化能力,同时不影响细胞的增殖活性。第三部分黄连素通过Wnt/p-catenin信号通路促进骨髓间充质干细胞的成骨分化[目的]进一步研究黄连素促进BMSCs成骨分化的作用机制。Wnt/β-catenin信号通路在骨生物学中发挥重要作用,Runx2、OSX、OCN、OPN是该通路的下游靶基因,第二部分实验证实,黄连素上调BMSCs成骨相关基因Runx2、OSX、OCN、OPN等的表达,黄连素可能通过Wnt/β-catenin信号通路促进间充质干细胞的成骨分化。本部分探讨Wnt/β-catenin信号通路是否参与黄连素促进BMSCs成骨分化的过程。[方法]将0、1、3、10、30 μM的黄连素加入成骨诱导培养基,培养1、3、7天,提取BMSCs的的总蛋白、细胞浆蛋白、细胞核蛋白,Western Blot检测β-catenin的蛋白表达。SABC-CY3免疫组化进行免疫荧光染色,观察β-catenin蛋白的亚细胞定位。双荧光素酶报告基因检测β-catenin与TCF/LEF(T-cell factor/Lymphoid enhancer factor)转录因子的作用活性。Wnt信号通路特异性抑制剂DKK-1预处理间充质干细胞,观察在阻断Wnt/β-catenin信号通路的情况下,黄连素对干细胞成骨分化的影响。[结果]黄连素处理细胞3天,与对照组相比,各加药组总蛋白提取物中β-catenin蛋白水平显著升高(P0.05),3、10μM药物组胞浆蛋白水平显著升高(P0.05),各组胞核β-catenin蛋白积累均显著高于对照(P0.05),且最高相比对照组增加了 3倍左右。3 μM黄连素孵育细胞72 h,细胞免疫荧光的结果示胞内β-catenin蛋白积累增加,并且向细胞核移位;3μ ^黄连素孵育细胞24 h,TOP flash/Fop flash双荧光素酶报告基因检测结果示,β-catenin/TCF的转录活性升高,升高至对照组的2倍左右。Wnt特异性抑制剂DKK-1预先加入细胞孵育24 h以阻断Wnt信号,然后加入3 μM黄连素,加药3天后DKK-1+ BBR组的β-catenin蛋白表达和ALP活性与BBR组相比显著降低(P0.05);加药7天后DKK-1+ BBR组的ALP、COLI、OCN mRNA表达与未做任何处理的对照组相比有所上调,但明显低于BBR组CP0.05);此外,DKK-1+BBR组的细胞钙结节形成与BBR组相比明显减少。[结论]Wnt/β-catenin信号通路参与黄连素促进间充质干细胞成骨分化的过程。
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【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R781.4

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