间接共培养对牙髓干细胞与脐带间充质干细胞增殖和成骨分化的影响

发布时间：2018-04-24 16:04

  本文选题：牙髓干细胞 + 脐带间充质干细胞　； 参考：《山东大学》2017年硕士论文

【摘要】：研究背景与目的在口腔组织工程研究中,人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,hDPSCs)与人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)作为成体干细胞,都被证实可以促进颌面部硬组织的缺损修复,对于口腔组织再生有较大意义。然而,hDPSCs与hUCMSCs在细胞来源、体外培养难度、增殖能力、多向分化能力等方面各有优劣,在一定程度上限制了他们的研究与应用。因而,探索优化现有干细胞如hDPSCs与hUCMSCs等的生物学特性的方法很有意义。细胞的旁分泌是指细胞分泌的各种调节因子进入到细胞间隙,对邻近的其他细胞的生物学特性起调控作用。大量研究表明,干细胞具备旁分泌功能,其产生的细胞因子、外泌体等物质可以影响到周围包括组织细胞、免疫细胞、肿瘤细胞等在内的多种细胞,对他们的增殖、粘附、凋亡等诸多行为起着不同的影响效应。近年来更有学者发现,不同种类的干细胞之间同样可以通过旁分泌作用相互影响增殖、分化等能力,如果能对这些改变加以利用,可能会对推进干细胞在组织工程中的研究进程有潜在价值。已有研究证实,hDPSCs和hUCMSCs都具有旁分泌功能,然而二者通过旁分泌对彼此生物学特性的影响尚不清楚。利用Transwell嵌套建立的细胞间接共培养体系是研究旁分泌的有力模型,可以更好模拟体内环境中两种细胞同时相互影响的状态。因此,本实验利用Transwell嵌套,于体外建立hDPSCs与hUCMSCs的间接共培养体系,以初步探究间接共培养环境中hDPSCs与hUCMSCs的旁分泌对彼此增殖及成骨分化能力的影响。本实验旨在为干细胞旁分泌效应的利用提供理论依据,为优化hDPSCs与hUCMSCs在口腔组织工程中的应用提供新的思路。材料与方法1.利用酶消化组织块法分离、培养原代hDPSCs与hUCMSCs;利用流式技术检测干细胞表面标志,利用成骨、成脂诱导检验多向分化潜能;进行hDPSCs与hUCMSCs的传代与冻存、复苏。2.建立hDPSCs-hUCMSCs体外间接共培养体系,并设置上下层含同种细胞的体系作为对照。间接共培养处理3d、5d时,通过EdU标记法及Western Blot分别测定细胞的增殖活力及周期相关蛋白CDK6与CYCLIN A的表达水平。3.设置预先共培养(间接共培养后进行成骨诱导)组与持续共培养(间接共培养的同时进行成骨诱导)组及各自的对照组,通过QRT-RCR和Western Blot技术分别测定成骨相关mRNA(Col I,RUNX2,OCN)的表达水平及成骨相关蛋白(Col I,RUNX2,OPN)的表达水平。4.通过Western Blot检测间接共培养后hDPSCs内Akt/mTOR通路核心元件表达情况。实验结果1.成功分离培养原代hDPSCs与hUCMSCs;hDPSCs与hUCMSCs皆具有间充质干细胞特异表面标记并可以成骨、成脂分化;成功进行hDPSCs与hUCMSCs的传代培养与冻存、复苏。2.同对照组相比,间接共培养3d及5d后的hDPSCs内EdU标记阳性率提高、CDK6和CYCLIN A蛋白表达水平上升,差异有统计学意义;间接共培养3d及5d时的hUCMSCs内EdU标记阳性率、CDK6和CYCLIN A蛋白表达水平与对照组无显著性差异。3.与对照组相比,间接共培养同时进行成骨诱导的hDPSCs内的Col I、RUNX2、OCN的mRNA表达量及Col I、RUNX2、OPN的蛋白表达量呈不同程度增加,差异有统计学意义;预先共培养后进行成骨诱导的hDPSCs内的Col I、RUNX2、OCN的mRNA表达量及ColⅠ、RUNX2、OPN的蛋白表达量呈不同程度增加,差异有统计学意义。与对照组相比,间接共培养同时进行成骨诱导及预先共培养后进行成骨诱导的hUCMSCs内上述指标无显著性改变。4.与非共培养组相比,间接共培养后hDPSCs内Akt、mTOR磷酸化程度增强。实验结论与意义在hDPSCs-hUCMSCs体外间接共培养体系中,hUCMSCs的旁分泌作用可促进hDPSCs的增殖及成骨分化,而hDPSCs的旁分泌对hUCMSCs的增殖与成骨分化能力未见明显影响;间接共培养体系中旁分泌影响hDPSCs特性的机制可能与Akt/mTOR信号通路有关。此研究结果表明,间接共培养体系中hUCMSCs的旁分泌对hDPSCs增殖与成骨有正向促进效果,这为优化hDPSCs与hUCMSCs在组织再生研究中的应用提供了新思路。
[Abstract]:In recent years , it has been found that human dental pulp stem cells ( hDPSCs ) and human umbilical cord mesenchymal stem cells ( hUCMSCs ) can be used as adult stem cells to study the biological characteristics of hDPSCs and hUCMSCs . The results showed that the expression levels of the mRNA and the level of protein expression in hDPSCs were significantly increased compared with those in the control group .

【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R782

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本文编号：1797313