炎性因子TNF-α对小鼠骨硬化蛋白的转录后调控机制研究

发布时间：2018-04-24 16:32

本文选题：骨硬化蛋白 + 转录后调控　；参考：《山东大学》2017年硕士论文

【摘要】：目的在炎症性骨疾病中,肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)为高表达的炎症因子之一,可通过调控多个信号通路参与疾病的进展。作为经典Wnt信号通路的抑制因子,骨硬化蛋白(Sclerostin,Sost)基因通过调控经典WWnt信号通路在炎症环境下骨组织代谢中发挥重要的调节作用。然而目前对Sost基因的转录后调控机制尚缺乏系统研究。本研究拟采用TNF-α处理MC3T3-E1小鼠胚胎前成骨细胞系(MC3T3-E1细胞)及原代培养的小鼠颅骨成骨细胞(原代成骨细胞),并构建Sost基因3'端非编码区(3'untranslated region,3'UTR)荧光素酶报告基因载体,以期明确TNF-α是否参与Sost基因表达的转录后调控。另外,TNF-α可影响多种微小RNA(microRNA,miRNA)在生物体内的表达,而研究发现miR-204-5p及miR-218可特异性结合到Sost基因的3' UTR并在转录后水平抑制Sost对基因的表达。为进一步探究TNF-α对Sost基因的转录后调控机制,本研究拟采用TNF-α处理MC3T3-E1细胞及原代成骨细胞,并检测TNF-α影响下miR-204-5p及miR-218的表达及功能变化,以明确TNF-α对Sost基因表达的转录后调控是否通过特异性miRNAs实现,同时初步探索其中涉及的信号通路。方法第一部分:(1)使用不同浓度的TNF-α分别处理MC3T3-E1细胞及原代成骨细胞不同时间,通过实时荧光定量聚合酶链反应技术(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)和蛋白质印迹法(western blot,WB)检测Sost基因的mRNA和蛋白质表达水平。(2)采用PCR克隆Sost基因的3'UTR区,并将其连接到荧光素酶报告基因载体pMIR-REPORT上,所获得的重组载体命名为pMIR-REPORT-SOST UTR。(3)将pMIR-REPORT-SOST UTR或pMIR-REPORT分别转染至原代成骨细胞、MC3T3-E1细胞及NIH3T3小鼠胚胎成纤维细胞系(NIH3T3细胞)中,根据转染质粒的种类将细胞分别命名为pMIR-REPORT-SOST UTR组和pMIR-REP0RT组,检测各组细胞中荧光素酶的表达水平。第二部分:(1)将 pMIR-REPORT-SOST UTR 或 pMIR-REPORT 转染入 MC3T3-E1 细胞中,根据转染质粒的种类将细胞分别命名为pMIR-REPORT-SOST UTR组和pMIR-REPORT组。转染72小时后检测两组细胞中荧光素酶的表达水平。在检测前使用不同浓度的TNF-α诱导两组细胞不同时间。(2)用不同浓度的TNF-α处理MC3T3-E1细胞及原代成骨细胞不同时间,通过RT-qPCR检测细胞中miR-204-5p及miR-218的表达水平。(3)将 miR-204-5p 的模拟物(miR-204-5p mimics)转染入 HEK293细胞及MC3T3-E1细胞中以实现miR-204-5p的过表达,转染了阴性对照miRNA模拟物(mimic NC)的HEK293细胞及MC3T3-E1细胞作为对照。转染24小时后用Ong/ml 或 15ng/ml TNF-α 处理细胞48小时,以 RT-qPCR 检测 miR-204-5p的表达水平。根据转染物及处理方法的不同将细胞分别命名为mimic NC组、miR-204-5p 组、mimic NC +TNF-α 组以及 miR-204-5p+TNF-α 组。(4)将 pMIR-REPORT-SOST UTR 和 miR-204-5p mimics 或 mimic NC 共转染入MC3T3-E1细胞中,根据转染物的不同将细胞分为mimic NC组和miR-204-5p组。转染24小时后使用0ng/ml或15ng/ml的TNF-α分别处理细胞48小时,检测细胞中荧光素酶的表达水平。(5)采用NF-κ B信号通路抑制剂BAY 11-7082和/或TNF-α处理MC3T3-E1细胞及原代成骨细胞,将细胞分为Control组、TNF-α组、TNF-α+BAY 11-7082组以及BAY 11-7082组。处理细胞48小时后,检测Sost基因的mRNA和蛋白质表达水平,并检测miR-204-5p的表达水平。另外,将pMIR-REPORT-SOST UTR转染入MC3T3-E1细胞中。转染24小时后,使用BAY 11-7082和/或TNF-α处理细胞48小时,将细胞分为Control组、TNF-α组、TNF-α+BAY 11-7082组以及BAY 11-7082组,检测各组细胞荧光素酶的表达水平。结果第一部分:(1)在MC3T3-E1细胞及原代成骨细胞中,TNF-α可下调Sost基因的mRNA的表达水平,并上调Sost基因的蛋白表达水平,且这种调控作用随时间延长或浓度增加而愈加明显。(2)成功构建pMIR-REPORT-SOST UTR荧光素酶报告基因载体,经测序鉴定无误。(3)在原代成骨细胞及MC3T3-E1细胞中,pMIR-REPORT-SOST UTR转染组的荧光素酶表达水平均显著低于pMIR-REPORT转染组。在NIH3T3细胞中,pMIR-REPORT转染组和pMIR-REPORT-SOST UTR转染组的荧光素酶表达水平无明显差异。第二部分:(1)使用TNF-α处理MC3T3-E1细胞后,pMIR-REPORT-SOST UTR转染组的荧光素酶表达水平仍旧低于pMIR-REPORT转染组。但是,随着TNF-α作用浓度的增加和作用时间的延长,pMIR-REPORT-SOST UTR转染组的荧光素酶表达水平逐步增加。当TNF-α的浓度达到及超过15ng/ml或作用时间达到48小时后,pMIR-REPORT-SOST UTR转染组的荧光素酶表达水平虽仍略低于pMIR-REPORT转染组,但差别已无统计学意义。(2)在MC3T3-E1细胞及原代成骨细胞中,TNF-α可显著下调miR-204-5p的表达,但对miR-218的表达水平影响不大。(3)在 HEK293 细胞及 MC3T3-E1 细胞中,miR-204-5p 组内 miR-204-5p 的表达水平远大于mimic NC组,而miR-204-5p+TNF-α组内miR-204-5p的表达水平亦远大于mimic NC+TNF-α组。另外,miR-204-5p组与miR-204-5p+TNF-α组相比较,miR-204-5p的表达水平无显著性差异,提示使用本实验中的方法过表达miR-204-5p时,细胞内源性miR-204-5p表达量的影响可以忽略不计。(4)将 pMIR-REPORT-SOST UTR 和 miR-204-5p mimics 或 mimic NC 共转染入MC3T3-E1细胞后,我们发现miR-204-5p组细胞中荧光素酶的表达水平较mimic NC 组降低30%。将 pMIR-REPORT-SOST UTR 和 miR-204-5p mimics或mimic NC共转染入MC3T3-E1细胞并对细胞施加TNF-α刺激后,我们发现miR-204-5p组内荧光素酶表达水平较mimic NC组降低28%。加用TNF-α刺激并未显著改变miR-204-5p对荧光素酶表达水平的影响程度,提示miR-204-5p对Sost基因3' UTR的结合和抑制功能不受TNF-α刺激的影响。(5)BAY 11-7082不影响TNF-α对Sost基因mRNA表达的抑制作用,但可完全逆转TNF-α对Sost基因蛋白质表达的促进作用。另外,TNF-α对miR-204-5p表达的抑制作用也可被BAY 11-7082不同程度地逆转。在转染了pMIR-REPORT-SOST UTR重组载体的MC3T3-E1细胞中,TNF-α组的荧光素酶表达水平显著高于Control组,但BAY 11-7082完全逆转了 TNF-α对荧光素酶表达的促进作用。结论第一部分:TNF-α参与了 Sost基因表达的转录后调控。将成功构建的pMIR-REPORT-SOST UTR转染入不同种类的细胞中,发现通过Sost基因3' UTR作用的转录后调控机制具有细胞特异性。第二部分:虽然TNF-α对miR-218的表达无明显调控作用,但TNF-α可通过抑制miR-204-5p的表达在转录后水平增加Sost基因的蛋白质表达水平。然而,在MC3T3-E1细胞中TNF-α并不影响miR-204-5p对Sost基因3' UTR的结合及其抑制功能。TNF-α对Sost基因表达的转录后调控在相当大的程度上是通过NF-κB信号通路实现的。
[Abstract]:Objective To investigate the expression of miR - 204 - 5p and miR - 218 in the pathogenesis of inflammatory bone diseases . The expression of miR - 204 - 5p and miR - 218 was regulated by means of real - time quantitative polymerase chain reaction ( RT - qPCR ) and Western blot . ( 3 ) The expression levels of miR - 204 - 5p and miR - 218 were detected by RT - qPCR . The expression levels of miR - 204 - 5p and miR - 218 were detected by RT - qPCR . ( 2 ) After 48 hours of transfection , the expression level of luciferase in pMIR - REPORT - SOST - induced transfection group was significantly lower than that of pMIR - REPORT - SOST . Results The expression level of luciferase in the pMIR - REPORT - SOSTRs transfected group was significantly lower than that of pMIR - REPORT - SOST . The expression level of miR - 204 - 5p in the miR - 204 - 5p group was significantly higher than that in the NC group . The transcriptional regulation of the expression of TNF - 伪 on the sost gene is achieved by means of NF - 魏B signal pathway .

【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R781

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