组织工程化牙周复合体修复牙周组织缺损

发布时间：2018-06-02 01:48

本文选题：牙周组织工程 + 种子细胞　；参考：《河北医科大学》2015年博士论文

【摘要】：目的牙周组织缺损或丧失常见于牙周病和牙周创伤。牙周组织缺损最理想的愈合是达到牙槽骨、牙骨质和牙周膜的完全功能性再生,从而获得牙周新附着。目前在临床上,采用牙周翻瓣术、植骨手术以及引导组织再生等技术可以通过不同的方式终止病变的发展,使病变组织得到一定的恢复。但要达到牙周组织的完全再生,尤其是牙周新附着的建立,目前尚未解决。如何利用再生性治疗方法获得牙周新附着,重建天然牙周组织的解剖结构和支持功能,是国内外学者所追求的目标和着力研究的热点课题。组织工程理论的提出和技术的发展,为牙周组织再生领域提供了新的思路和方法。牙周组织工程技术的核心是构建种子细胞与支架材料的三维空间复合体。以往的研究表明,作为牙周组织再生基础的牙周膜细胞(periodontal ligament cells,PDLCs)来源非常有限,且大多数研究都集中于把组织工程其他领域的支架材料直接或通过简单的表面修饰用于牙周组织工程,以致牙周组织很难达到有效的组织再生和功能重建。因此,种子细胞的来源、适宜支架材料的选择、种子细胞与支架材料复合体的构建成为牙周组织工程技术亟待解决的难题。本实验运用组织工程学方法,以Beagle犬牙龈成纤维细胞(gingival fibroblasts,GFs)作为种子细胞,与Bio-Gide胶原膜和小肠黏膜下层(small intestinal submucosa,SIS)支架材料复合培养,体外构建组织工程化牙周复合体,体内重建牙周组织修复犬牙周组织缺损,组织学观察牙周组织再生和新附着建立情况。初步探讨构建组织工程化牙周复合体及其用于牙周组织再生的可行性,为进一步利用组织工程原理实现牙周组织再生性治疗的临床研究提供实验数据和理论依据。方法:1牙周复合体支架材料的选择及降解实验1.1小肠黏膜下层支架材料的制备取自封闭饲养的成年猪空肠50 cm,按Abraham方法制备。1.2 Bio-Gide胶原膜支架材料1.3 Bio-Gide胶原膜和小肠黏膜下层支架材料降解实验分别在大鼠两侧皮下各平铺放置Bio-Gide胶原膜和小肠黏膜下层支架材料各一块,严密缝合皮肤并染色标记植入位置。1.4标本HE染色观察支架材料降解情况2牙龈成纤维细胞的体外培养及矿化诱导2.1 Beagle犬牙龈成纤维细胞的体外培养及鉴定采用组织块法进行Beagle犬牙龈成纤维细胞原代培养。细胞免疫组化波形蛋白(vimentin)染色及扫描电镜观察鉴定牙龈成纤维细胞。2.2 Beagle犬牙龈成纤维细胞的矿化诱导及鉴定取原代培养Beagle犬牙龈成纤维细胞第2~3代对数生长期细胞,更换完全培养液为矿化诱导液。每隔48小时换液一次。诱导培养第11天,倒置显微镜下观察形成矿化结节。2%茜素红染色、1%硝酸银染色鉴定矿化结节。3组织工程化牙周复合体的构建3.1组织工程化牙周膜的构建将制备好的Beagle犬牙龈成纤维细胞,以2×106个/ml细胞浓度双面接种于Bio-Gide胶原膜支架材料上,生长7天。3.2组织工程化矿化膜的构建将制备好的Beagle犬牙龈成纤维细胞,以2×106个/ml细胞浓度单面接种于小肠黏膜下层支架材料上。完全培养液静置培养,3天后,换以矿化诱导液诱导培养8天。3.3组织工程化牙周复合体(组织工程化的矿化膜+牙周膜+矿化膜)的“三明治”结构的构建由组织工程化的矿化膜+牙周膜+矿化膜构建“三明治”结构的组织工程化牙周复合体。4组织工程化牙周复合体重建的动物实验4.1牙周组织缺损动物模型的建立及分组正常对照组:没有任何创伤,保留正常的牙周结构。牙周创伤组:建立牙周组织缺损后,不做任何治疗处理,龈瓣复位,严密缝合。组织工程化牙周膜组:建立牙周组织缺损,将组织工程化牙周膜植入牙周组织缺损内,龈瓣复位,严密缝合。组织工程化牙周复合体组:建立牙周组织缺损,将“三明治”结构的组织工程化牙周复合体,植入牙周组织缺损内,龈瓣复位,严密缝合。4.2组织工程化牙周复合体修复牙周组织缺损的实验观察分别于术后10、20、30天时间点各处死3只动物,取上下颌骨,按分组分段切取实验牙及牙槽骨,标本固定于10%福尔马林中,脱钙,HE染色。结果:1牙周复合体支架材料的选择及降解实验1.1支架材料植入术后动物大体观察所有大鼠均健康成活,无伤口红肿等炎性反应,切口均一期愈合,至处死时均无感染、无移植物排出,进食和活动正常。各时间点支架材料植入局部组织均未见坏死等异常表现,材料未见包裹形成。1.2组织学观察1.2.1支架材料植入术后2周Bio-Gide胶原膜支架材料植入后2周,可见Bio-Gide胶原纤维断裂,少量成纤维细胞长入胶原纤维间隙,另有少量淋巴细胞、浆细胞等炎细胞浸润。小肠黏膜下层支架材料植入后2周,小肠黏膜下层结构仍清晰可辨,可见成纤维细胞长入及大量新生毛细血管,局部有淋巴细胞、浆细胞等炎细胞浸润。1.2.2支架材料植入术后4周Bio-Gide胶原膜支架材料植入后4周,可见Bio-Gide胶原纤维肿胀、断裂,成纤维细胞长入胶原纤维间隙。小肠黏膜下层支架材料植入后4周,小肠黏膜下层可见降解明显,己出现纤维结构松散、断裂,淋巴细胞、浆细胞等炎细胞减少。1.2.3支架材料植入术后6周Bio-Gide胶原膜支架材料植入后6周,可见Bio-Gide胶原纤维肿胀、断裂明显,大量成纤维细胞长入。小肠黏膜下层支架材料植入后6周,小肠黏膜下层继续降解,但仍可见少量支架结构,局部少量淋巴细胞、浆细胞浸润,大量成纤维细胞长入。1.2.4支架材料植入术后8周Bio-Gide胶原膜支架材料植入后8周,可见Bio-Gide胶原纤维断裂、消失,大量成纤维细胞长入。小肠黏膜下层支架材料植入后8周,小肠黏膜下层大部分降解,局部少量淋巴细胞、浆细胞浸润,大量成纤维细胞长入。1.2.5支架材料植入术后10周Bio-Gide胶原膜支架材料植入后10周,Bio-Gide胶原膜支架材料结构消失,完全降解,而被脂肪、纤维等结缔组织取代。小肠黏膜下层支架材料植入后10周,小肠黏膜下层支架材料基本完全降解,大量成纤维细胞长入。1.2.6支架材料植入术后12周小肠黏膜下层支架材料植入后12周,小肠黏膜下层支架材料完全降解,被大量成纤维细胞、脂肪组织、新生毛细胞血管及胶原所取代。2牙龈成纤维细胞的体外培养及矿化诱导2.1 Beagle犬牙龈成纤维细胞体外培养及鉴定Beagle犬牙龈成纤维细胞原代培养第3天,可见梭形细胞向组织块周围爬出,大多数为长梭形,胞体丰满,胞浆均匀,胞核大呈圆形或椭圆形位于中央,胞质向外伸出2~3个长短不等的突起,小部分细胞呈扁平多边形。继续培养6~7天后,倒置显微镜下可见Beagle犬牙龈成纤维细胞以组织块为中心呈放射状、漩涡状生长。第2代Beagle犬牙龈成纤维细胞对抗波形蛋白(vimentin)染色阳性,胞浆呈棕黄色着色,阳性颗粒分布均匀,细胞核染为蓝色。扫描电镜观察,可见Beagle犬牙龈成纤维细胞体积较大,轮廓清楚,多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构,其细胞核呈规则的卵圆形,核仁大而清晰。2.2 Beagle犬牙龈成纤维细胞体外矿化诱导及鉴定Beagle犬牙龈成纤维细胞体外诱导矿化第11天,倒置显微镜下,可见大小不等的矿化结节形成,色深近黑色,呈圆形或椭圆形。茜素红染色结果显示,Beagle犬牙龈成纤维细胞体外矿化诱导第11天,可见大小不等的橘红色钙化结节,为茜素红与钙盐形成的复合物。1%硝酸银染色结果显示,Beagle犬牙龈成纤维细胞体外矿化诱导第11天,可见大小不等的黑色及黑褐色钙结节形成,说明有大量钙盐沉积,即矿化结节形成。3组织工程化牙周复合体的构建3.1组织工程化牙周膜的构建将Beagle犬牙龈成纤维细胞双面接种于Bio-Gide胶原膜支架材料上,构建组织工程化牙周膜。扫描电镜观察结果显示,Bio-Gide胶原膜支架材料具有良好的多孔网状结构,牙龈成纤维细胞在其上贴附牢固,生长旺盛,伸展充分。牙龈成纤维细胞与Bio-Gide胶原膜支架材料形成的复合物为纤维网状组织,具备牙周膜的纤维状结构。3.2组织工程化矿化膜的构建将Beagle犬牙龈成纤维细胞单面接种于小肠黏膜下层支架材料上。矿化诱导液诱导培养8天,倒置显微镜下观察,可见矿化结节形成。扫描电镜观察结果显示,小肠黏膜下层具有良好的多孔网状结构,牙龈成纤维细胞在其上贴附牢固,生长旺盛,可见矿化结节形成,体外成功构建组织工程化矿化膜。3.3组织工程化牙周复合体的构建组织工程化的矿化膜+牙周膜+矿化膜的“三明治”结构的组织工程化牙周复合体,形成类似牙槽骨、牙周膜和牙骨质的正常结构,外观呈海绵状,具有一定的机械性能和可塑性。4组织工程化牙周复合体重建的动物实验研究4.1牙周组织缺损动物模型的建立术前Beagle犬的牙周状况良好,牙龈无红肿,未探及牙周袋,翻瓣术中也未见牙槽骨缺损。实验共分四组,采用自身对照,每只Beagle犬的双侧上下颌四个象限第2、3、4前磨牙为实验牙,从左上颌、右上颌、再到左下颌、右下颌,分别为正常对照组、牙周创伤组、组织工程化牙周膜组和组织工程化牙周复合体组。采用外科手术方法造成Beagle犬牙周组织的急性损伤,使每颗实验牙近中根的近中侧和远中侧形成2 mm的牙周组织缺损,缺损从牙颈部直达根尖1/3,根面用龈下刮治器去除牙周膜及表面牙骨质。4.2组织工程化材料植入术后动物大体观察所有Beagle犬术后均健康存活到实验结束,活动及饮食正常,手术切口一期愈合,未见感染及并发症。组织工程化材料植入牙周组织缺损后,未见材料溢出,植入局部和全身均未见明显不良反应。4.3组织学观察4.3.1组织工程化材料植入术后第10天正常对照组:Beagle犬前磨牙根分叉区可见牙骨质、牙周膜、固有牙槽骨、松质骨。其中,松质骨由骨小梁和骨髓组成,骨小梁粗大致密,大小不均的骨髓间隙散在分布,间隙内可见脂肪细胞。牙周创伤组:术后10天,牙骨质未新生,牙周膜未修复,有少量新生牙槽骨。组织工程化牙周膜组:术后10天,未见牙周膜形成。组织工程化牙周复合体组:术后10天,可见新形成的牙周膜纤维,大量新生骨开始形成骨小梁,牙骨质开始重建。4.3.2组织工程化材料植入术后第20天正常对照组:Beagle犬前磨牙根分叉区可见牙骨质、牙周膜、固有牙槽骨、松质骨。其中,松质骨由骨小梁和骨髓组成,骨小梁粗大致密,大小不均的骨髓间隙散在分布,间隙内可见脂肪细胞。牙周创伤组:术后20天,牙骨质未新生,牙周膜未修复,有少量新生牙槽骨形成。组织工程化牙周膜组:术后20天,牙骨质处于重建中,可见新生的牙槽骨和牙周膜纤维。组织工程化牙周复合体组:术后20天,牙骨质修复完成,牙槽骨重建完成,牙周膜纤维结构清晰。4.3.3组织工程化材料植入术后第30天正常对照组:Beagle犬前磨牙根分叉区可见牙骨质、牙周膜、固有牙槽骨、松质骨。其中,松质骨由骨小梁和骨髓组成,骨小梁粗大致密,大小不均的骨髓间隙散在分布,间隙内可见脂肪细胞。牙周创伤组:术后30天牙骨质未新生,牙周膜未修复。组织工程化牙周膜组:术后30天,牙骨质处于重建中,可见成骨细胞和新生的牙周膜纤维。组织工程化牙周复合体组:术后30天,牙骨质修复完成,牙周膜成熟,穿通纤维清晰,牙周新附着形成。结论1牙龈成纤维细胞具有较强的分化能力和矿化诱导的潜力,能够形成矿化结节。为组织工程化矿化膜的构建,提供种子细胞。2牙龈成纤维细胞接种于Bio-Gide胶原膜支架上,成功构建组织工程化牙周膜。3牙龈成纤维细胞接种于猪小肠黏膜下层支架上,诱导矿化,成功构建组织工程化矿化膜。4将双层组织工程化矿化膜,中间夹上组织工程化牙周膜,成功构建“三明治”结构的组织工程化牙周复合体。5组织工程化牙周膜在动物体内能修复牙周组织缺损,获得牙周组织再生,但牙槽骨和牙骨质的形成缓慢。6组织工程化的矿化膜+牙周膜+矿化膜的“三明治”结构的牙周复合体在动物体内能完全修复牙周组织缺损,获得最为理想的牙周组织结构。
[Abstract]:Objective To study the effects of periodontal tissue regeneration on periodontal tissue regeneration and to establish a new method for the regeneration of periodontal tissues . Tissue - engineered periodontal ligament complex was used to construct periodontal tissue defect . The tissue - engineered periodontal complex was implanted into periodontal tissue defect . The tissue engineering periodontal ligament was implanted into periodontal tissue defect . A tissue engineered periodontal ligament was constructed . The results showed that the tissue engineered periodontal complex had a good porous network structure , and the gingival fibroblasts were well attached to the periodontal ligament . Tissue engineering periodontal ligament group : 20 days after operation , alveolar bone and cancellous bone were observed . Tissue engineered periodontal ligament was successfully constructed by tissue engineering periodontal ligament in the middle clamp . The tissue engineering periodontal ligament could be used to repair the periodontal tissue defect in the animal , and periodontal tissue regeneration was achieved .
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R783.1

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