低强度脉冲电磁场对成骨细胞在不同形貌钛表面生物学行为的影响

发布时间：2018-06-18 22:14

  本文选题：脉冲电磁场 + 骨结合　； 参考：《第四军医大学》2014年博士论文

【摘要】：种植体/骨界面反应是指在种植体植入至功能负重后，种植体表面和骨之间以及邻近骨组织进行的一系列骨形成、骨吸收和骨改建的过程。种植体的成功与否取决于种植体/骨界面的结合方式，上世纪七十年代Br nemark教授提出了骨结合理论。骨-种植体的骨结合是代谢活跃的骨组织和具有生物相容性的异质材料的结合，以及在后续功能负载条件下的持续的结合状态。在众多异质材料中，钛及钛合金种植体在临床应用过程中取得了良好的成功率，因而钛及钛合金成为目前应用最为广泛的种植体材料。然而这类种植体依然存在两大主要问题：首先种植体植入体内后通常需要3-6个月的愈合期；其次一些全身因素，如骨质疏松、糖尿病、口干症以及放射治疗都会影响种植体的骨结合，进而导致种植体成功率和存在时间的下降。在骨科和口腔种植等重建性治疗领域，快速牢固的骨结合可以扩大适应证范围，提高种植体的成功率，缩短临床负载前的等待时间。因此，如何获得快速且有效的骨/种植体结合对于生物材料领域是一项重要挑战。众多学者致力于研究提高种植体骨结合的策略，，其中包括种植体表面改性、药物缓释系统及辅助疗法的应用等。生物物理性刺激作为一种有效提高种植体周围骨发生和骨沉积的物理辅助疗法，近年来得到了广泛的重视。 PEMF全称低强度脉冲电磁场，它是一种新兴的非电离，不产热，非接触的物理治疗手段，这种疗法安全可靠，在骨、软骨相关疾病治疗领域应用最为广泛。PEMF应用于常规手段治疗效果较差的骨、软骨相关疾病，如骨折延迟愈合、骨不连、骨质疏松等，能取得良好的效果；其已被FDI批准，成为促进骨组织、软骨组织愈合的重要辅助疗法。有学者研究发现在电磁场中可以观察到骨组织物理应力的改变，这些改变加速了骨微结构的生成和代谢；同时PEMF在组织中形成的微小磁场有利于骨组织的愈合，同时能减轻炎症反应的发生。目前认为PEMF促进骨修复的机制在于其有效促进了成骨细胞的活性。尽管有众多研究证实PEMF有显著地促成骨作用，然而对于PEMF在种植体表面的成骨作用研究较少。近年来，一些学者开始研究PEMF对于种植体骨结合的影响，结果提示，PEMF能有效促进动物体内种植体的骨结合。然而，这些研究大多是动物体内实验的对比研究或有效参数的筛选，而对于PEMF影响种植体骨结合机制的探索并不深入。本课题旨在研究：（1）PEMF如何影响钛种植体表面成骨细胞的粘附、增殖、分化等生物学行为；（2）PEMF对于不同类型种植体表面（Flat、Micro和Nano）上成骨细胞生物学行为的影响是否也不相同；（3）PEMF如何影响种植体表面成骨相关基因和蛋白的表达，并初步探讨PEMF影响成骨细胞生物学行为的信号通路。 第一部分，不同形貌钛试件的制备及PEMF的参数筛选 电磁场刺激对于不同的细胞存在不同的参数窗口，本部分内容对PEMF作用于不同形貌钛试件表面成骨细胞的脉冲强度、频率等参数进行了筛选。首先制备了三种钛材料表面，分别为机械抛光组（Flat）、酸蚀喷砂组（Micro）和阳极氧化组（Nano）。分别置于对照无电磁场刺激（control）和8组不同参数的电磁场刺激下，研究材料表面原代成骨细胞的增殖情况。而后选取了1Hz和15Hz两种频率的脉冲模式和0.1mT，0.5mT，1mT和5mT四组强度参数进行参数组合筛选。结果提示三种材料表面PEMF对于成骨细胞作用的 效应窗口‖存在一定差异，在后续试验中选用对三种材料表面成骨细胞均有明显效应的15Hz、1mT的电磁场参数进行研究。 第二部分，PEMF对不同形貌钛表面成骨细胞粘附增殖分化的影响 本部分采用蛋白吸附、荧光染色、MTT、ALP染色、茜素红染色等实验方法对PEMF影响材料表面成骨细胞的粘附、增殖、分化进行系统性研究。还采用了场发射扫描电镜和激光共聚焦显微镜对材料表面的细胞微形态进行了观察。结果表明PEMF组三种试件表面蛋白粘附数量与相应对照组相比都明显提高。在0.5h时，尽管三组材料在PEMF刺激下细胞早期粘附量与对照组相比都有一定程度的提高，但是并没有统计学差异。在1h和1.5h时，三组材料在PEMF刺激下细胞早期粘附量与对照组相比显著增多（p0.05）。SEM和CLSM观察结果提示，在PEMF作用下，成骨细胞显示出不同的显微结构和定向分布，但是物理学刺激并没有影响成骨细胞在不同材料表面的伪足形式，其中Nano表面主要表现为板状伪足，而Flat和Nano表面主要表现为丝状伪足。在PEMF作用下，成骨细胞呈现与电磁场方向垂直的分布特征，并且成骨细胞内部可观察到更多的细胞微丝和应力纤维；相反，对照组大多数细胞并没有展示出有序排列或者高度分化的细胞骨架。细胞增殖结果提示在4d和7d时，PEMF刺激组三种表面的细胞数明显高于对照组，其中Nano/PEMF组的与Nano/Control组相比增长最为明显，增加了135%。Flat和Micro组在经过PEMF和对照处理至7d时，ALP的活性并没有显著差异，但是14d时，PEMF处理组的成骨细胞的细胞外基质（ECM）较对照组显著增加。这些实验结果表明PEMF在早期促进了成骨细胞的增殖而在晚期促进了成骨细胞的分化。 第三部分，PEMF对不同形貌钛表面成骨相关基因、蛋白的影响 本部分主要对成骨相关的关键基因和蛋白进行了分析。PEMF上调了成骨相关基因alp、ocn、bmp2、col-1、runx2和osx基因的表达水平。其中bmp2是对PEMF刺激最为敏感的基因，4d和7d时PEMF均促进了bmp2基因的上调，4d时三组材料分别上调了0.9倍(Flat)、1.6倍(Micro)和1.7倍(Nano)；7d时分别上调了1.6倍(Flat)、1.9倍(Micro)和3.1倍(Nano)，结果均有统计学差异（p0.05）。检测细胞培养液上清的分泌型BMP-2的含量，发现培养4d后，PEMF处理组在Micro和Nano表面上成骨细胞BMP-2分泌量与对照组相比显著提高（p0.05），在Flat表面经PEMF处理后，BMP-2分泌量与对照组相比有一定提高，但无统计学差异；培养7d后，PEMF处理组在三种表面上成骨细胞BMP-2分泌量与对照组相比均显著提高（p0.05）。而后检测了BMP2/Smad通路上的重要蛋白，PEMF刺激后活化的p-Smad1/5/8含量升高，下游蛋白Runx-2和OSX的蛋白表达量也有所提高。而加入Noggin抑制剂后，活化的p-Smad1/5/8含量明显降低， Runx-2和OSX的蛋白表达量也有所减低。这一结果强烈提示我们，PEMF对纯钛试件表面成骨细胞增殖、分化的影响可能是通过BMP/Smad信号通路发挥作用。 本研究的实验结果证实脉冲电磁场能促进不同表面形貌钛材料（Flat、Micro、Nano）上成骨细胞的成骨活性，表现在PEMF可显著增加蛋白吸附，进而促进成骨细胞在钛表面的粘附，导致细胞内更多的微丝和应力纤维形成，PEMF能促进纯钛表面成骨细胞的增殖和分化，上调了成骨相关基因的表达，而这一过程可能是通过BMP/Smad信号通路发挥作用。本研究还发现，PEMF对三种不同形貌的钛材料表面成骨细胞的成骨活性促进程度存在差异，提示不同种植体表面形貌和PEMF刺激对成骨细胞的成骨活性可能存在协同作用。
[Abstract]:Implant / bone interface reaction refers to a series of bone formation , bone resorption and bone remodeling processes between implant surface and bone and adjacent bone tissue following implantation of implant to function . The success of implant depends on the combination of implant / bone interface . In many heterogeneous materials , titanium and titanium alloy are the most widely used implant materials .
Second , some systemic factors , such as osteoporosis , diabetes , xerostomia and radiotherapy , affect the bone union of implants , which leads to the reduction of implant success rate and time .

PEMF is an emerging non - ionizing , heat - free , non - contact physical therapy , which is safe and reliable , and is widely used in the treatment of bone and cartilage related diseases . PEMF is used in the treatment of bone and cartilage related diseases such as fracture delayed union , bone fracture , osteoporosis and so on .
It has been approved by FDI as an important auxiliary therapy for promoting the healing of bone tissue and cartilage . Some scholars have found that the changes of physical stress of bone tissue can be observed in electromagnetic field , which accelerate the formation and metabolism of bone microstructure ;
In recent years , some scholars have begun to study the effect of PEMF on implant bone union .
( 2 ) The influence of PEMF on the biological behavior of osteoblasts on different types of implant surface ( Flat , Micro and Nano ) was different .
( 3 ) How PEMF affects the expression of bone - related genes and proteins on the surface of implants , and preliminary studies on the signal pathways of PEMF on the biological behavior of osteoblasts .

First part , preparation of titanium test piece with different morphology and parameter selection of PEMF

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本文编号：2037043