殊异韦荣菌苹果酸脱氢酶基因的克隆及其重组蛋白的表达，纯化和活性测定

发布时间：2018-06-30 18:42

  本文选题：韦荣菌 + 苹果酸脱氢酶　； 参考：《吉林大学》2014年硕士论文

【摘要】：殊异韦荣菌（Veillonella dispar）是口腔中一种常见的革兰阴性厌氧小球菌，是较早定植于牙菌斑中的常驻菌。苹果酸脱氢酶（Malatedehydrogenase，MDH）在殊异韦荣菌代谢产酸的过程中起到调节作用，对龋病的发生和发展起着重要的作用。在这个实验中，以殊异韦荣菌为研究对象，对它的苹果酸脱氢酶基因进行克隆及重组表达，并对其重组蛋白进行纯化及活性测定，为苹果酸脱氢酶在龋病诊断和治疗中的作用奠定基础。 在本实验的第一部分中，提取殊异韦荣菌基因组DNA，并通过PCR聚合酶链式反应扩增MDH基因序列，将PCR产物和pET-28a-c(+)载体进行EcoRⅠ、SalⅠ双酶切，并用T4DNA连接酶将其连接，连接产物转化至大肠杆菌DH5α中，，经EcoRⅠ、SalⅠ双酶切和PCR鉴定，并进行测序验证。PCR扩增产物特异，全长1139bp。测序结果经BLAST软件分析，包含MDH基因及其前后片段，通过基因序列和氨基酸分析证明其具有完整的阅读框架，该基因序列已经登陆GenBank，序列号为KC421072。在本实验第二部分中，将鉴定正确的重组质粒MDH-pET-28a-c(+)转化至大肠杆菌BL21（DE3）中进行重组表达，并对其表达条件进行优化。重组质粒MDH-pET-28a-c(+)成功的在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，其表达的重组蛋白大约为36kb。经过设置不同诱导剂浓度梯度、相同诱导时间以及不同诱导时间梯度、相同诱导剂浓度成功的得出重组质粒MDH-pET-28a-c(+)在大肠杆菌BL21(DE3)中的最佳诱导表达条件为IPTG终浓度为0.5mmol/L,37℃诱导6h，并经过超声破菌鉴定其表达形式为可溶性蛋白。最后对重组蛋白进行高效表达，并对其进行纯化和活性测定，其活性测定值为0.4403U/ml。 本实验成功克隆出殊异韦荣菌苹果酸脱氢酶基因MDH并通过基因序列和氨基酸分析证明其具有完整的阅读框架。获得了重组表达MDH蛋白的最佳表达条件，并测出了苹果酸脱氢酶的活性，这为进一步研究苹果酸脱氢酶提供了条件，为研究苹果酸脱氢酶在龋病的诊断和治疗中的作用奠定了基础。
[Abstract]:Veillonella dispar is a common gram-negative anaerobic micrococcus in oral cavity. Malate dehydrogenase (MDH) plays an important role in the metabolic process of acid production by isoveronium, and plays an important role in the occurrence and development of caries. In this experiment, the malate dehydrogenase gene was cloned and expressed, the recombinant protein was purified and its activity was determined. To lay a foundation for the role of malate dehydrogenase in the diagnosis and treatment of caries. In the first part of this experiment, we extracted the genomic DNA of E. heterovaronis and amplified the MDH gene sequence by PCR polymerase chain reaction. The PCR product and pET-28a-c () vector were digested with EcoR 鈪

本文编号：2086474