表面处理工艺对纯钛种植体生物学性能影响的对比研究

发布时间：2018-07-28 14:50

【摘要】：临床上以纯钛或钛合金为材料的牙种植体得到了广泛应用,但是由于天然钛表面的氧化层较薄,在临床上需要较长的愈合时间来获得种植牙的成功,因此需要钛表面改性技术来缩短种植牙愈合的时间和提高种植牙的成功率。目前,常用的一些表面处理技术包括羟基磷灰石涂层,喷砂、酸蚀、微弧氧化,紫外线光催化技术等等。多年来中外众多学者做了大量的研究表明与光滑种植体表面相比,这些表面处理技术明显改善了种植体的表面活性,促进了种植体与骨的结合。然而众多学者的研究中针对这些表面处理技术所采用的处理参数都各不相同。同一种表面处理技术在不同的处理参数条件下,得到的种植体表面性质也各不相同,所以得出的实验结果也不相同。长期以来由于缺少对同一种表面处理方法不同处理参数之间的对比研究,也就没法确定出比较合适的处理参数。本实验在设计之初发现这一问题之后,与材料学院相关专业进行合作研究,针对同一种表面处理方法的不同处理参数进行了大量的对比研究,得出了各种处理方法相对最适合的处理参数,结论如下： 1、纯钛微弧氧化膜表面的微观形貌、粗糙度、显微硬度、膜重、膜厚、物相结构、元素组成等随着氧化时间不同呈现出相应的改变,当氧化20min时纯钛基体微弧氧化膜即生长完成。纯钛微弧氧化工艺模型分析表明其氧化膜微观结构、物相组成等与工艺参数之间存在必然的联系。其中,微弧氧化工艺时间参数(t)是最主要的工艺参数,膜层结构及其他各参数都受工艺时间(t)的影响,工艺参数t决定了微弧氧化的加工时间。 2、喷砂纯钛基体表面在45s的喷砂时间呈现出一定微观粗糙度与显微硬度的较好组合。 3、氢氟酸和盐酸混合溶液与基体钛及其氧化层能够发生酸蚀化学反应,影响了纯钛基体的微观形貌及力学性能,酸蚀纯钛基体表面在90s的酸蚀时间组合了明显的α+β复相组织结构。 4、喷蚀对纯钛试样主要产生了喷砂和腐蚀的综合作用,纯钛基体经过45s时间喷砂及120s的酸蚀预处理,试样表面具有喷砂和酸蚀综合作用效果,并去除了喷砂作用的残留物。在此结论的基础上制定出了酸蚀、喷蚀、微弧氧化的最适处理参数如下： 1、空白对照组：商用二级纯钛板(TA2)切割成Φ3.O×10.0mm和Φ8.0×3.0mm的试件。依次以用SiC防水砂纸(320目、600目、800目、1200目)同方向逐级打磨至表面呈金属光泽,表面划痕一致。再依次以丙酮,无水酒精和去离子水超声清洗15min(每步骤重复2次),常温干燥。 2、酸蚀组参数：酸液：HF(40%)、HCI(38%)；比例：6：4；体积：40m1；温度：室温；时间：70s。； 3、喷砂+酸蚀组参数： (1)喷砂：：磨料：SiC；粒度：200m；气压：0.9MP；流量：2.10m/min；时间：40s；角度：70度；距离：：15cm；清洗：丙酮、去离子水清洗,电吹风干； (2)酸蚀：：酸液：HF(40%)、HCI(38%)；比例：6：4；体积：40m1；温度：室温；.时间：l00s； 4、微弧氧化组参数：电压：500V；频率：550Hz：占空比：25%；电解液：30mmol/l (CH3C00)2Ca·H2O,10mmol/l C3H7Na206P.5H20,8mmol/1NaOH；温度：低于40度；时间：18min；在此参数条件下进行本实验研究。 1种植体表面处理 1.1研究目的本实验为了评估微弧氧化纯钛种植体生物学性能,运用“复合制备工艺设计+工艺条件优化”的研究方法,在优化了的条件下,采用酸蚀、“喷砂+酸蚀”(喷蚀)、微弧氧化表面处理方法对纯钛试样进行处理,以改善纯钛试样的理化性能和生物活性等为目的,对于纯钛基体表面形貌、表面粗糙度及硬度、表面元素组成等方面进行系统性深入分析,横向对比了酸蚀、喷砂酸蚀及微弧氧化膜纯钛试样的表面微观结构、物相组成、粗糙度及硬度等内容,为后期的体外细胞培养和体内动物实验做好材料准备,为纯钛种植材料的开发提供实验依据。 1.2研究方法：由陕西宝鸡金属材料有限公司提供,选用TA2工业纯钛产品纯钛棒材制作试样。材料的力学性能及化学成分等技术标准符合GB/T2956-2007要求。将纯钛棒材用数控线切割机床CNC分别加工成10.0mm厚度和3.0mm厚度的试样,即得到①3.0×10.0mm和Φ8.0×3.0mm圆柱形TA2纯钛试样。用180-600#金相砂纸分别将试样表面磨光至表面微观粗糙度Ra=0.2μmm,其中Φ8.0×3.0mm试样用于试验方案中种植体表面处理研究和体外细胞培养试验,Φ3.0×10.0mm只做为体内动物试验试样。分组并分别对试样进行酸蚀、喷蚀、微弧氧化处理。扫描用电子显微镜(Scanning ElectronMicroscopy, SEM)观察各组试件表面微形貌,X射线能谱仪(Energy DispersiveX-ray spectroscopy, EDS)检测试件表面相对元素含量。用华银HV-1000型数显显微硬度计测量试样的显微硬度值,用北京时代集团生产的TIMETR200型粗糙度仪测试试样表面微观粗糙度Ra数值。所有结果使用SPSS17.0软件统计进行单因素方差分析。 1：3实验结论 1.3.1表面形貌(扫描电镜结果) 空白组表面有砂纸打磨出较长且较浅的划痕；酸蚀组纯钛基体明显被腐蚀出许多平行的针状沟痕,具有清晰的台阶和针状显微组织；喷蚀组纯钛基体表面除了保留有喷砂作用的切削痕迹外,被腐蚀出一些方向不同且成束的针片状组成物,尤其是喷砂嵌入基体的残余磨粒被腐蚀掉了,整个纯钛基体表面展现出喷砂与酸蚀复合作用的处理效果；微弧氧化膜组纯钛试样基体表面呈现出凹凸不平均匀连续的氧化膜,氧化膜表面有较多的孔洞,多呈圆形椭圆形分布。MAO处理能使纯钛表面生成多孔疏松的膜层,其表面有类似于“骨小梁”的结构。 1.3.2表面粗糙度表面粗糙度发生变化,可以影响植体表面的动态接触角,使材料的的亲水性发生改变。经过测试,光滑组打磨后的纯钛基体的Ra值是0.2μm；酸蚀处理后试样粗糙度Ra达到1.08μm；喷蚀处理后试样的粗糙度Ra为1.67μm；微弧氧化处理后试样Ra值为1.68μm。 1.3.3表面硬度通过检测得纯钛基体的维氏硬度值是220HV0.025；酸蚀硬度达181HV0.025。喷蚀后硬度为259HV0.025；微弧氧化处理后的硬度为670HV0.025。说明微弧氧化膜具有较强的抗压强度。 1.3.4纯钛基体表面元素组成纯钛表面主要是钛,占99.336%,其他元素的含量如下：铁0.120%碳0.020%氮0.020%氢0.004%氧0.100%其他少于0.400%酸蚀组经过HF、HCL双重酸蚀后,能谱分析未见任何铝、硅离子的污染,提示双重酸蚀可完全去除包裹在钛表面的A1203颗粒及Si02的污染,说明样品表面污染物和氧化膜被去除干净；喷蚀组当腐蚀90s时试样表面的Si,C元素相对含量分别减少为3.90%和4.81%；微弧氧化组各工艺阶段试样表面X射线能谱中的0, Ti元素的特征谱线峰值都比较强,试样表面的EDS谱还显示了氧化膜中Ca,P元素的特征谱线。微弧氧化工艺处于18min时,试样氧化膜中的Ca元素的相对含量为11.25-9.93%,P元素含量为3.04～2.68%,因为纯钛微弧氧化膜物相分析中除发现少量Ca3(P04)2外,无其他含Ca,P元素的化合物存在,说明有些Ca,P元素或以离子态或非晶态存在于微弧氧化膜中。 2.体外细胞培养本实验通过扫描电镜、倒置显微镜,应用胎牛血清,ST2细胞,在处理后的4组Φ8.OX3.0mm的纯钛试件上进行了细胞培养,研究不同的表面处理的纯钛试件表面理化性能及生物活性的变化。 2.1试验分组及方法 2.1.1试样分组： A、空白对照B、酸蚀C、喷蚀D、微弧氧化 2.1.2取出液氮中保存的细胞,进行细胞复苏,细胞传代,开始进行细胞计数； 2.1.3对数期的细胞进行接种观察ST2细胞在纯钛表面的黏附情况,进行形态学的观察、计数；研究四种纯钛试样对ST2细胞增殖功能影响的检测；研究四种试样对ST2细胞分化功能影响的检测,分别测定碱性磷酸酶的活性,骨钙素的含量——ELISA的检测； 2.2试验结果 2.2.1、细胞毒性试验根据MTT法测定的OD值计算相对增值率(RGR),细胞相对增值率RGR%=OD实验组/OD阴性对照组X100%。根据不同时期各组RGR值进行细胞毒性分级(CTS)。由本实验结果可知：四组纯钛试样浸提液与阴性对照组比较均无差异显著(P0.05),CTS分级均为0级,说明本研究所采用的纯钛种植体无毒性,符合《医疗器械生物学评价国家标准GB/T16886.1—2001》中对材料细胞毒性的要求。 2.2.2ST2细胞黏附实验----形态学观察、计数细胞粘附是细胞增殖及分化的前提,细胞的早期附着与种植材料的表面形貌、化学成分有密切的关系。镜下可见空白组表面细胞胞体较扁平,长轴与表面沟纹方向一致,表面初步伸出丝状伪足和板状伪足,数目较少。酸蚀组表面细胞呈纺锤体状,中央胞核较饱满,可见板状伪足,深入孔洞内。喷蚀组表面细胞呈梭形,表面呈现很多丝状伪足和板状伪足突起,放射状伸入周围孔洞内。微弧氧化组表面细胞呈树突状,中央胞核较饱满,可见板状伪足深入孔洞内,表面大部分细胞附着在圆滑形凹陷内,丝状伪足较好的附着在表面孔洞的边缘,伸展较好。部分细胞还伸展出板状伪足,表现出较典型的多角形。MAO处理后样品表面形成富含钙磷的疏松多孔结构,增加了粗糙度,有利于材料对蛋白的吸附并介导细胞附着。 2.2.3细胞增殖根据MTT实验原理,OD值越大在培养的初期就说明粘附于钛片表面的活细胞越多；在培养后期则表示钛片表面增殖的细胞越多。因此MTT实验根据时间点的不同分别说明了不同表面处理的纯钛试样表面对细胞的初期附着和后期增殖的影响。培养后的3、5和7天,细胞生长曲线说明了对纯钛基体表面进行优化表面处理后有利于细胞增殖。培养第1、3、5和7d后,B、C和D组时间表面成骨细胞的增殖比A组好。第1天,各组的增值情况相差不多,无明显差异。第3,第5和第7天,同一时间点上,D组均是高于B,C与A组,其差异存在统计学意义,p0.5,但是B组和C组之间无明显差异,p0.05,不存在统计学意义。总的来说,增殖的总趋势是：DB=CA,B、C组之间不存在统计学意义。 2.2.4细胞的分化 2.2.4.1四组纯钛试样对ST2细胞ALP活性的检测细胞分化的标志主要表现为较高的ALP活性,合成I型胶原,表达骨钙素(OC)和骨桥蛋白。细胞层内高水平的ALP活性能促进矿化组织的形成,加快骨形成。ALP的表达与细胞的分化有关,ALP的活性水平代表了细胞的分化程度。本实验中,对组试件表面ST2细胞ALP活性进行比较,在培养后的第3、5、7天后,可看到同时期内微弧氧化处理后的纯钛试件的ALP含量均处最高水平,B、C、D三组处理表面ALP含量都高于A组,且(p0.5)存在统计学意义,B组优于C组但无统计学意义；D组明显优于B组和C组,(p0.5),其差异存在统计学意义。 2.2.4.2四组纯钛试样对ST2细胞OC8含量的影响分析四组纯钛试样对于ST2细胞分泌OCN的ELISA检测结果,各组OCN的浓度都随着时间而不断升高。在每个检测时间点,B、C和D组OC的合成均高于A组(p0.05),D组的OC合成比B、C的高(p0.05),总的高低趋势为DCBA。 3、动物实验 3.1实验方法优化处理后试样种植体分为4组：A组(空白对照)、B组(酸蚀)、C组(喷蚀)、D组(微弧氧化)。优选24只新西兰兔,雌雄不拘,身体状况良好,平均体重在2.5——3kg。将新西兰兔随机分为甲、乙两组。在甲组近心端植入A、B两种试样,远心端植入C、D两种试样；在乙组近心端植入C、D两种试样；远心端植入A、B两种试样。术后4周从甲、乙两组中随机各抽取一半的新西兰兔处死获取标本；8周后处死甲乙两组的另一半新西兰兔获取标本。取材后采用X线片检测、骨结合力实验、5倍显微镜下观、组织学观察对标本进行生物学性能分析。 3.2实验结果 3.2.1术后观察新西兰兔生长状况良好,所有种植钉(96枚)均未发生松动,脱落,存留完好,种植体与骨结合良好,部分种植钉顶部被骨皮质覆盖。种植体周围软组织未见感染、化脓、坏死；4周时,骨一种植体之间结合良好,种植体靠近骨髓腔的一面有新骨形成,8周时可以看到骨与种植体直接连接,没有看到间隙存在。标本取样后X线片显示,种植体植入方向和位置适当,种植体在兔股骨皮质骨和髓腔内,形成良好骨结合。5倍显微镜下可见植体与骨组织界面,空白对照组可见种植体周围骨质相对稀松,种植体表面可见骨组织接触较少,偶见间隙,B、C、D组植体周围骨质相对致密,种植体表面可见骨组织接触较多。微弧氧化组镜下显示种植体与骨组织紧密嵌合无缝隙长入。 3.2.2顶出实验结果 4周、8周测试时间点,骨-种植体界面抗剪切强度表现为ABCD,B、C、D与A组相比差异有统计学意义(P0.05),试验组中B、C组与D组差异有统计学意义(P0.05),B组与C组间无统计学差异(P0.05), 3.2.3组织学结果(不脱钙硬组织切片,HE染色) 4周时,可见纯钛组界面主要为结缔组织和类骨质成分为主,只有少量新骨形成,而微弧氧化组可见较多骨小梁形成,新生的骨小梁边缘可见大量单层排列的低柱状成骨细胞,8周时,纯钛组界面处可见少量的骨小梁,以编织骨为主,也可见大量的类骨质和结缔组织共存,大量成骨细胞排列于新生骨周围,成骨较活跃。微弧氧化组8周时,界面大部分由骨组织构成,部分骨小梁已逐渐融合成不规则的密质骨,新骨周围仍可见大量的单层排列成骨细胞。硬组织切片实验发现,酸蚀与喷蚀组钛种植体周围骨结合情况相近,两组的BIC值的差异无统计学意义,空白组中BIC明显降低,与之相反,微弧氧化组BIC明显升高,与A、B、C组的差异有统计学的意义(P0.05)。 4、结论 1、酸蚀、喷砂+酸蚀、微弧氧化三种表面处理工艺均能不同程度改变纯钛种植体的理化性质,提高其生物学性能。 2、喷蚀呈现出喷砂加酸蚀的复合效应,生物学性能优于单独酸蚀处理。 3、微弧氧化处理后的种植体的生物学性能优于酸蚀和喷蚀处理,多种表面处理工艺的复合研究将成为未来种植体表面优化处理的新热点。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R783

【参考文献】