应力条件下Notch1通路对人牙周膜干细胞分化调控作用的探索性研究

发布时间：2018-12-19 08:24

【摘要】：在临床正畸治疗中,错位牙定向移动是成、破骨活动相互协调的结果。在牙周膜受压应力侧,破骨细胞主导的优势破骨吸收活动是正畸牙矫治性移动的前提;而在张应力侧,成骨细胞主导的优势新骨沉积活动能修复正畸牙移动中形成的牙槽骨缺损,是正畸牙矫治性移动中安全性的根本保证。但这种新骨沉积活动所需成骨细胞的来源过去一直存在争议。受Seo等成功分离培养人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,PDLSC)的启发,本课题组前期成功完成了动态张应力促PDLSC向成骨细胞转化的实验研究,证实PDLSC是矫治性牙位移动与牙槽骨应力改建过程中成骨细胞的主要来源。在合适的临床阶段增强PDLSC应力成骨作用,理论上能促进正畸牙固位,改善正畸过程中的牙周损伤,对提高临床矫治质量和安全性具有重要意义。但PDLSC分化早期启动阶段何种信号通路发挥了决定性作用,目前尚未得到充分研究。对人体其它位置间充质干细胞分化调控机制的研究表明:Notch1信号通路在多种组织器官的间充质干细胞早期分化调控中扮演重要角色,可能直接决定间充质干细胞的分化命运。由于PDLSC本质上是一种位于牙周膜特殊位置的间充质干细胞,受其他学者对Notch1信号研究的启发,我们推测PDLSC应力分化早期可能也受到Notch1信号的调控。为验证此猜想,我们设计了本实验,以激动剂重组人Jagged1蛋白(Jagged1)、抑制剂γ-分泌酶抑制剂(γ-Secretase Inhibitor,DPAT)调控Notch1信号通路,通过标准Western Blot(WB)方法检测Notch1信号通路胞内段(Notch intracellular domain,NICD)、PDLSC成骨标志物ALP和BMP2表达变化,以验证Notch1信号通路对PDLSC应力分化过程的影响。目的:在细胞应力实验中,通过化学方法调控PDLSC中Notch1信号表达,探究动态张应力条件下Notch1通道在PDLSC分化过程中发挥的作用。方法1.分离、体外培养和鉴定人牙周膜干细胞在日常临床实践中随机选取牙体牙周状况均健康,且年龄为14~20周岁需正畸拔除前磨牙的患者,经充分解释知情同意后,取其刚拔除的新鲜正畸牙。自冠方向根方单向刮取根中段牙周膜组织,以Ⅰ型胶原酶恒温37oC消化45分钟,消化完成后收集组织块,加入培养液并重新制悬后种于培养皿中。待细胞长满孔底接近80%左右面积时以有限稀释法分选PDLSC并传代。取第4~6代PDLSC以免疫荧光检测角蛋白、波形蛋白确定细胞组织来源;通过成骨及成脂诱导分化后以茜素红和油红O染色鉴定细胞多向分化能力,确定所获的细胞为PDLSC。2.PDLSC应力分化早期过程中Notch1信号通路的变化趋势该实验设计目的是了解PDLSC应力分化过程早期,Notch1通路的表达变化情况。将传至第4~6代PDLSCs接种于应力加载专用Bio Flex硅胶底膜六孔培养板内。采用国际标准化Flexercell-4000 tension动态张应力加载装置进行应力加载,应力加载程序为形变率0-12%的正弦波,频率为0.1Hz即每舒张后回复一次,每次持续5s。连续作用时间分别为:0h、6h、12h、24h,每个时间段结束后WB检测。WB检测处理后PDLSC早期分化成骨标志物ALP、BMP2以反映PDLSC分化情况;Notch1信号通路关键蛋白NICD的表达,以反映Notch1信号通路变化情况。3.Notch1信号通路对PDLSC应力条件下分化分化过程的调控作用通过DAPT抑制、Jagged1激活Notch1信号通路,探索其对PDLSC应力分化的影响。抑制剂组(记为DAPT组)加入DAPT根据说明书建议和预实验结果采用10μmol/L;激动剂组(记为Jagged1组)加入浓度为10ng/L的Jagged1,该浓度根据文献与本实验组前期研究确定;溶剂对照组(记为DMSO组)加入溶剂DMSO,终浓度与DAPT组相同为1x10~(-2)mol/L;作用时间分别为:0h、6h、12h、24h。WB检测Notch1信号通路关键蛋白NICD的表达以及PDLSC早期分化成骨标志物ALP、BMP2。结果1.成功通过有限稀释法从离体正畸牙上分离培养得到纯化PDLSC。光镜下胞体细长,呈多边形或长梭形;具有较强单克隆形成能力,生长速度较快;螺旋或涡漩状排列,低倍镜下可见多个涡旋中心;细胞单层排列。所获得的细胞免疫组织化学染色后,胞体波形蛋白阳性且不表达角蛋白,证明其属于间充质组织无上皮来源污染;化学诱导成骨实验,处理组14d后有矿化结节形成,能被茜素红染成红色;化学诱导成脂,处理组14d后胞体内有脂滴形成,大小不一,能被油红O染色。这些结果说明分离培养所获得细胞具有较强多向分化潜力且为间充质组织来源,符合PDLSC特征。2.经加力设备连续施加动态张应力0h、6h、12h、24h后,PDLSC早期分化成骨标志物ALP、BMP2表达成上升趋势(P0.05);Notch1信号通路关键蛋白NICD表达呈下降趋势,PDLSC应力分化早期Notch1通路处于抑制状态。3.DAPT作用下Notch1通路关键蛋白NICD的表达量下降大于非处理组(P0.05),DAPT成功抑制Notch1通路;DAPT处理组应力加载后PDLSC早期分化成骨标志物ALP、BMP2表达成上升趋势,且表达量大于非处理组(P0.05),分化为成骨细胞能力上升。4.Jagged1作用下Notch1通路关键蛋白NICD的表达量增加大于非处理组(P0.05),Jagged1成功激活Notch1通路;Jagged1处理组应力加载后PDLSC早期分化成骨标志物ALP、BMP2表达依然呈上升趋势,但表达量小于非处理组(P0.05),PDLSC分化为成骨细胞能力下降。结论本实验证实:①在PDLSC应力分化早期过程中,Notch1信号通路处于抑制状态。②抑制剂下调Notch1表达后,PDLSC在应力作用下分化为成骨细胞的趋势增强。③激动剂上调Notch1表达后,PDLSC在应力作用下分化为成骨细胞的趋势减弱。这些数据表明:Notch1信号通路参与了PDLSC应力分化的早期过程,并发挥了抑制分化的作用。我们过去的工作已经证明:PDLSC应力分化是正畸治疗中牙移动后再固位于牙槽骨成骨作用所需成骨细胞的主要来源,PDLSC应力分化是多种信号通路协同作用的结果,不同信号间存在众多复杂联系与交互作用。为进一步完善前期工作,为指导临床正畸治疗提供更坚实可靠的理论基础,本课题选择尚未在PDLSC中被研究过的Notch1信号通路,完成了对其影响PDLSC早期应力分化的初步研究。从目前的实验结果我们可以推测Notch1信号通路对PDLSC应力分化过程发挥抑制作用。PDLSC在应力作用下成骨分化是正畸牙固位的生物学基础,在合适的临床治疗阶段通过下调Notch1通路活性,促进PDLSC成骨分化,理论上可以提高临床治疗的安全性,此实验结果还有望用于牙周疾病造成的牙槽骨缺损修复。通过我们建立的动态张应力实验研究模式,能更深入地了解Notch1通路在PDLSC应力分化过程中的具体分子调控机制。相信我们的实验结果能拓宽Notch1在口腔正畸方面的应用前景,为Notch1信号成为临床治疗新的作用靶点提供更坚实的理论基础。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R783.5

【参考文献】